中等强度运动对2型糖尿病小鼠血糖及部分免疫指标的影响

高澜 李心璇 范欣雨

作者单位：310058 浙江大学医学院公共卫生系

当前糖尿病在全球范围内已成为人类健康首要威胁之一。截至2021 年，全球大约有5.37 亿20～79 岁成年人患有糖尿病，我国糖尿病患者已达1.409 亿，居世界首位［1］。2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是以β 细胞功能障碍、胰岛素抵抗为特征的代谢性疾病［2］，慢性炎症在驱动胰岛素抵抗和2 型糖尿病发病中起关键作用［3］。近年来研究发现Th17 细胞、Treg 细胞及相关细胞因子与T2DM 发病有关［4］。Th17 细胞和Treg细胞是CD4+T 细胞亚群，在获得性免疫中起重要作用。Th17 细胞促进炎症发展［5］，而Treg 细胞可抑制过强的免疫反应［6］。研究表明，合适强度的运动有利于改善Treg/Th17 比例失衡［7］。考虑到高强度运动对免疫功能可能的抑制作用，本研究选取中等强度运动作为干预方式。目前运动对糖尿病Treg、Th17 细胞失衡的影响尚未见报道。本研究拟通过检测中等强度运动对糖尿病小鼠血糖、体重、胸腺系数、脾系数、Treg/Th17 细胞比值的影响，探讨运动对糖尿病血糖的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 db/db 小鼠是Leptin 受体点突变小鼠，出生后6 周出现明显肥胖和高血糖症状，常用作2 型糖尿病研究模型［8］。野生型小鼠20 只［7 周龄，雄性，体重（21.63±2.72）g，血糖（8.34±1.71）mmol/L）］、db/db 小鼠16 只［7 周龄，雄性，体重（43.60±4.54）g，血糖（27.97±5.72）mmol/L）］，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。

1.2 实验器材及试剂 GA-3 型血糖仪及试纸，购自三诺生物传感股份有限公司；cytoFLEX LX 流式细胞仪，购自Beckman Coulter 国际贸易（上海）有限公司、；ZH-PT 型动物实验跑台；小鼠Th17 染色试剂盒、Treg细胞染色试剂盒，购自杭州联科生物技术股份有限公司；4%甲醛固定液、1%戊巴比妥钠麻醉药、PBS 灌流液。

1.3 实验方法 （1）动物分组：野生型小鼠与db/db 小鼠随机分为四组，分别为野生型小鼠非运动（WT）组10 只和野生型小鼠运动（WTE）组10 只、db/db 小鼠非运动（DM）组8 只、db/db 小鼠运动（DME）组8 只。运动干预期间，野生型小鼠运动组、db/db 小鼠非运动组、db/db 小鼠运动组分别死亡2 只、3 只、1 只。（2）中等运动强度的确定及运动干预：以5 m/min 为初始跑步速度，每3 min 增加1 m/min。各组小鼠以相同速度奔跑至少10 min 且无法以更高速度奔跑，视作达到最大运动速度。取最大运动速度测量值60%，结合文献及小鼠运动实际情况，确定中等运动强度为12 m/min，坡度0°，每次共运动45 min（期间休息三次，每次5 min）。小鼠适应跑台一周后，进行为期5 周，每周5次的正式运动干预。（3）小鼠体重及餐后血糖测定：每周进行一次小鼠体重及餐后血糖测定。按摩小鼠尾静脉，75%乙醇消毒，待干后剪尾尖采血1 滴于血糖试纸上。使用GA-2 型快速血糖仪检测末梢静脉全血中葡萄糖浓度。（4）胸腺指数与脾系数测定：实验结束后，称取四组小鼠体重，皮下1%戊巴比妥麻醉后手术。打开胸腔，心尖插入导管针头进行灌流。取出并称量胸腺及脾脏重量，计算胸腺系数及脾系数。

（5）脾组织单细胞悬液制备3 mL DMEM 培养基中加入3 mg 木瓜蛋白酶、3 mg 胶原酶、10U DNA 水解酶。脾组织剪碎后置于37℃恒温消化15 min，吹打细胞使充分混合。重复上述步骤3 次，至无肉眼可见的组织块。通过200 目尼龙网过滤后置于离心管中，2,000 rpm 离心5 min，弃上清液。加入含10%胎牛血清PBS 2 mL，2,000 rpm 离心5 min，弃上清液；加入1 mL PBS 培养液，吹打细胞至单细胞悬液。（6）Treg 细胞染色及百分比检测：流式管中加入1～10×106脾细胞、5μL Anti-Mouse CD4，FITC 和5μL Anti-Mouse CD25，APC。涡旋震荡混匀，室温避光孵育15 min。每管加入2 mL 1×FCM Lysing Solution 工作液，涡旋震荡混匀，室温避光孵育15 min。室温300～400×g 离心5 min 弃上清。每管加入2 mL 1×Flow Cytometry Staining Buffer，涡旋震荡混匀。室温300～400×g 离心5 min，弃上清。每管加入1 mL Fixation/Permeabilization 工作液，涡旋震荡混匀。室温避光孵育30～60 min。每管加入2 mL 1×Permeabilization Buffer。室温300～400×g 离心5 min，弃上清。100μL 1×Permeabilization Buffer 重悬沉淀。加入5μL Anti-Mouse Foxp3，震荡混匀，室温避光孵育至少30 min。每管加入2 mL 1×Permeabilization Buffer，室温300～400×g离心5 min，弃上清。每管加入500 μL 1×Flow Cytometry Staining Buffer 重悬，使用流式细胞仪检测Treg 细胞比例。（7）Th17 细胞染色及百分比检测：流式管中加入100μL 细胞悬液，加入5μL Anti-Mouse CD3ε，FITC和5μL Anti-Mouse CD4，PerCP-Cy5.5。震荡混匀，室温避光孵育15 min。每管加入100μL FIX ＆ PERM Medium A，震荡混匀，室温避光孵育15 min。每管加入2 mL预冷1× Flow Cytometry Staining Buffer，300×g 离心5 min，弃上清。每管加入100μL FIX ＆ PERM Medium B 和5 μlAnti-Mouse IL-17A，PE。震荡混匀，室温避光孵15 min。每管加入2 mL 1×Flow Cytometry Staining Buffer，300×g 离心5 min，弃上清。每管加入500μL 1×Flow Cytometry Staining Buffer 重悬，使用流式细胞仪检测Th17 细胞。

1.4 统计学方法 采用IBM SPSS 26.0 统计软件。计量资料符合正态分布以（±s）表示，不符合正态分布以［M（P25，P75）］表示，多组数据比较采用单因素方差分析，涉及两个因素采用双因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 中等强度运动对db/db 小鼠体重与血糖的影响 db/db 小鼠各时间点餐后血糖均显著高于野生型小鼠。与运动干预前相比，运动后野生型小鼠血糖（6.92±1.29 mmol/LVS. 7.25±0.77 mmol/L，P＞0.05）和体重（24.59±2.19 gVS. 22.51±2.48 g，P＞0.05）均无显著变化，而db/db 小鼠血糖（17.37±3.50 mmol/LVS.28.71±3.69 mmol/L，P＜0.01）和体重（38.26±6.33 gVS.46.31±3.90 g，P＜0.01）均显著下降。

2.2 中等强度运动对胸腺系数的影响 db/db 小鼠非运动组胸腺系数显著小于野生型小鼠非运动组（1.40±0.32VS. 1.92±0.30，P＜0.01）。与运动干预前相比，运动后野生型小鼠（1.93±0.40VS. 1.92±0.30，P＞0.05）、db/db 小鼠（1.55±0.45VS. 1.40±0.32，P＞0.05）胸腺系数均增高，但无统计学差异，见图1。

图1 胸腺系数

2.3 中等强度运动对脾系数的影响 db/db 小鼠非运动组脾系数显著小于野生型小鼠非运动组（1.89±0.41VS. 4.15±0.39，P＜0.01）。与运动干预前相比，运动后野生型小鼠（3.55±0.42VS. 4.15±0.39，P＞0.05）、db/db 小鼠（1.81±0.33VS. 1.89±0.41，P＞0.05）脾系数差异无统计学意义，见图2。

图2 脾系数

2.4 中等强度运动对db/db 小鼠Treg/Th17 细胞比值的影响 与野生型小鼠非运动组相比，db/db 小鼠非运动组Treg 细胞（7.27%±1.59%VS. 8.44%±2.64%，P＞0.05）、Th17 细胞（2.19%±1.59%VS. 2.40%±1.50%，P＞0.05） 百 分 比、Treg/Th17 细 胞 比 值（2.99±1.34VS. 4.13±2.73，P＞0.05） 差异无统计学意义。运动干预后，db/db 小鼠Th17 细胞百分比（1.48%±0.76%VS. 2.19%±1.59%，P＞0.05），Treg 细胞百分比（7.91%±0.76%VS.7.27%±1.59%，P＞0.05），db/db小鼠运动组Treg/Th17 细胞比值与非运动组小鼠比（4.79±2.29VS. 2.99±1.34，P＞0.05），差异无统计学意义。见图3。

图3 Treg/Th17细胞比值

3 讨论

2 型糖尿病是一种代谢性疾病，其病理机制包括胰岛β 细胞功能障碍和胰岛素抵抗［2］。慢性炎症在驱动胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和导致2 型糖尿病中起关键作用［3］。T 细胞调控在IR 的发病机制及其相关疾病之间存在联系。Th17 和Treg 是CD4+T 细胞的亚群，负责获得性免疫［9］，IL-6 通过与TGF-β 的协同诱导Th17 细胞分化［10］，Th17 细胞通过分泌IL-17A/F、IL-22、IL-21、TNF-α 和其他炎症相关细胞因子而导致炎症和许多自身免疫性疾病包括T2DM 的发生［11］；而Treg 细胞具有免疫负性调节功能，在维持免疫稳态和耐受中发挥关键作用［12］。T2DM 患者的Th17 细胞百分比、IL-17 水平显著升高，Treg 细胞百分比、Treg/Th17 比值显著下降［13］，IL-17 降低糖耐量和胰岛素敏感度［14］。Th17 细胞、Treg 细胞失衡及其对胰岛β 细胞和相关组织的炎症作用促使T2DM 的发生发展［15］。

合适强度的运动有利于改善Treg/Th17 比例失衡，研究发现高强度游泳6 周后自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型（EAE）中枢神经系统Th1 和Th17 细胞减少，IFN-γ 和IL-17 降低，Treg 细胞增加，IL-10 和TGF-β升高。

本研究观察了中等强度运动对db/db 小鼠血糖、体重及免疫系统的影响，发现中等强度运动可显著降低db/db 小鼠餐后血糖；运动后db/db 小鼠体重亦有显著下降。本研究显示，运动干预前db/db 小鼠胸腺系数、脾指数均小于正常小鼠，与正常小鼠相比，db/db 小鼠Treg 细胞、Th17 细胞百分比降低，Treg/Th17 比值降低，出现Treg 与Th17 比例失调，提示T2DM 小鼠免疫系统异常。虽然没有统计学意义，但运动干预后db/db 小鼠胸腺系数有上升趋势；运动干预后db/db 小鼠Treg/Th17比值有明显增高、接近正常小鼠趋势，而正常小鼠运动干预前后Treg/Th17 比值无明显变化研究结果提示中等强度运动调节糖尿病小鼠Treg/Th17 比值失衡、抑制炎症反应可能是其预防、治疗糖尿病的机理之一。