黄蜀葵花不同开放程度对药材中总黄酮及其糖苷类成分含量及其提取率的影响

郭小藤，刘燕，张清华，尚立霞

(1.山东省药学科学院泰山学者重点实验室，山东 济南 250101；2.山东省药学科学院山东省生物药物重点实验室，山东 济南 250101)

黄蜀葵花为锦葵科秋葵属植物黄蜀葵[Abelmoschusmanihot(L.) Medic.]的干燥花冠(带雄蕊及花柱)，味甘性寒，归肾及膀胱经；具有清利湿热、消肿解毒的功效；内服用于湿热壅遏和淋浊水肿；外治痈疽肿毒，水火烫伤[1]。它作为药用始于宋代[2]，其后历代本草均有记载，民间应用历史悠久，并收载于各版《中国药典》以及江苏、山东等一些地方药材标准中。黄蜀葵花原产于我国南方，喜温暖湿润，现除西北地区外，全国各地均有栽培，主要产区有江苏、浙江以及安徽等[3-4]。黄蜀葵花含有上千种化合物，主要包括黄酮类、还原糖类、鞣质、甾醇类、多糖类化合物以及其他成分，其中黄酮类化合物为黄蜀葵花的主要活性成分，黄酮类成分中又以金丝桃苷和异槲皮苷含量最高[5-8]。药理学研究表明，黄蜀葵花的黄酮类成分具有保护心、脑缺血，改善肝、肾功能以及修复口腔黏膜溃疡等作用[9-10]。临床应用黄蜀葵花及其总黄酮治疗多种口腔炎症、慢性支气管炎，止痛效果显著，对慢性肾小球肾炎有明显疗效[11]。

中药材的采收、加工是其生产和品质形成的重要环节，对确保中药材质量和临床疗效有着十分重要的意义。历版《中国药典》仅规定黄蜀葵花于夏、秋二季花开时采摘，及时干燥。但目前关于黄蜀葵花开放程度对药材质量影响的相关报道尚少。因此，为了保证黄蜀葵花药材质量的优质和均一，本研究以金丝桃苷和异槲皮苷为对照品，采用紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法对黄属葵花药材中总黄酮、金丝桃苷和异槲皮苷成分进行含量测定，同时采用正交试验确定的总黄酮提取最佳工艺，考察药材的提取率，评价黄蜀葵花不同开放程度时药材的质量，为黄蜀葵花的合理开发及利用提供了科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器设备 Waters e2695高效液相色谱仪(2998PDA二极管阵列检测器，Waters Empower工作站，均为美国 Waters公司)；Agilent 8454 UV-Vis分光光度计(美国安捷伦)；Mettler XS-205电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多)；DNT-0.1/00多功能提取浓缩机组(浙江温兄机械阀业有限公司)；EYELA N-1100旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；KQ2200DA 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 金丝桃苷对照品(批号：111521-201809，含量:94.9%，中国食品药品检定研究院)；异槲皮苷对照品(批号：111809-201804，含量:97.2%，中国食品药品检定研究院)；黄蜀葵花药材产地均为江苏，经山东省药学科学院泰山学者重点实验室鉴定为锦葵科植物黄蜀葵[Abelmoschusmanihot(L.) Medic.]的干燥花；乙腈为色谱纯，磷酸为优级纯，其他试剂均为分析纯，超纯水为自制。

2 方法与结果

2.1 性状 黄蜀葵花药材的外观性状是其质量评价的重要部分，由于黄蜀葵花不属于大宗药材，市售黄蜀葵花药材外观性状差异较大，因此本研究对黄蜀葵花药材的花形及开放程度、花色进行了观察，并考察了外观性状与含量之间的相关性。江苏是黄蜀葵花药材种植规模较大的省份，花期为8—10月，本试验选用的药材均为江苏种植且在花期内不同开放程度的药材。

经过对6批药材样品外观性状的观察，发现其花形基本分为全开放形或半开放形、未开放螺旋卷状形等开放程度；花色分为亮黄色或黄色、黄色偏绿等颜色。其中全开放的花，花瓣大而舒展，花色为亮黄色；半开放的花，花瓣没有完全展开，花色多为黄色；未开放的花，花形为卷曲螺旋状，外层花瓣呈浅绿色，结果见表1、图1～2。

表1 黄蜀葵花药材来源及外观性状

A.全开放形；B.半开放形；C.未开放螺旋卷形图1 黄蜀葵花药材不同花形样品

A.亮黄色；B.黄色；C.黄色偏绿图2 黄蜀葵花药材不同花色样品

2.2 黄蜀葵花药材的提取 分别取不同开放程度的黄蜀葵花药材各4 kg，加85%乙醇回流提取两次，第一次12倍量，第二次10倍量，每次提取1 h，提取液滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.18～1.20(60 ℃)。将醇提浓缩液静置16～20 h，撇去上层油，即得醇提浸膏。分别称定醇提浸膏和油层的重量，计算本品醇提浸膏得率，结果见表2。

表2 黄蜀葵花药材提取结果

全开放的黄蜀葵花提醇提出膏率最高，油层最少；半开放的黄蜀葵花出膏率略低于全开放的花，去油率偏高；未开放的黄蜀葵花醇提浸膏出膏率最低，去油率高且油层结实。

2.3 总黄酮含量测定

2.3.1 供试品溶液的制备 取不同开放程度的黄蜀葵花药材样品粉末(过四号筛)0.5 g，每个样品各2份，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇100 mL，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液备用。取不同批次的醇提取样品0.15 g，置25 mL量瓶中，精密称定，加甲醇20 mL，超声处理20 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，离心10 min，取上清液备用。

2.3.2 对照品溶液的制备 取金丝桃苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含金丝桃苷80 μg的溶液，即得。

2.3.3 测定波长的选择 精密量取对照品溶液3 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取供试品溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀；以50%甲醇为空白，在200～800 nm范围内扫描吸收曲线。结果表明，金丝桃苷对照品与供试品溶液在256 nm波长处均有相同的最大吸收。

2.3.4 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分别置25 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀。以50%甲醇为空白，照紫外-可见分光光度法在256 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程：C=0.052 1A-0.001 1(R2=0.999 99)，线性范围为3.036 8～18.221 0 μg·mL-1。

2.3.5 含量测定 精密量取药材供试品溶液1.0 mL，置25 mL量瓶中，精密量取醇提浸膏供试品溶液1.0 mL，置50 mL量瓶中，分别加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，在256 nm处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中金丝桃苷的量，计算总黄酮含量。结果见表3。

表3 不同开放程度黄蜀葵花及醇提浸膏总黄酮含量测定结果(%,n=2)

全开放的黄蜀葵花样品中总黄酮含量及醇提转移率最高，半开放的黄蜀葵花总黄酮含量及醇提转移率略低于全开放的花，未开放的黄蜀葵花总黄酮含量和醇提转移率均最低，醇提浸膏中总黄酮含量趋势与药材基本一致。

2.4 金丝桃苷、异槲皮苷含量测定

2.4.1 色谱条件 Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(15∶85)，流速 1.0 mL·min-1，检测波长：360 nm，进样量：10 μL，柱温：35 ℃。

2.4.2 混合对照品溶液的制备 取金丝桃苷和异槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含金丝桃苷100 μg、异槲皮苷60 μg的混合溶液，即得。

2.4.3 供试品溶液的制备 取样品粉末(过四号筛)0.2 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入甲醇15 mL超声处理(功率100 W，频率40 kHz)30 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。取不同批次的醇提取样品0.15 g，置25 mL量瓶中，精密称定，加甲醇20 mL，超声处理30 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，离心10 min，取上清液作为供试品溶液。

2.4.4 专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图(见图3)。供试品溶液的色谱图中，在与对照品溶液的色谱图相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，且金丝桃苷峰、异槲皮苷峰与相邻峰之间的分离度均符合要求。

A.混合对照品溶液；B.供试品溶液 1.金丝桃苷 2.异槲皮苷图3 黄蜀葵花高效液相色谱图

2.4.5 样品含量测定 分别取黄蜀葵花不同部位药材粉末及不同批次的醇提取样品，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件测定，按外标法以峰面积计算金丝桃苷、异槲皮苷含量，结果见表4。

表4 不同开放程度黄蜀葵花及醇提浸膏金丝桃苷、异槲皮苷含量测定结果(%,n=2)

全开放的黄蜀葵花样品中金丝桃苷、异槲皮苷平均含量最高，半开放的黄蜀葵花中两成分平均含量略低于全开放的花，未开放的黄蜀葵花中两成分平均含量均最低，醇提浸膏中两成分含量趋势与药材基本一致。

3 讨论与结论

3.1 提取溶剂及方法考察 黄酮类成分是黄蜀葵花的有效部位，由于黄酮类成分在水中溶解度不高，多采用适当浓度的甲醇或乙醇作为溶剂，采用加热回流、超声或索氏等方法进行提取[12-13]。由于索氏和超声提取仅适合少量药材的提取，且甲醇的毒性较大，而乙醇具有价格低、易回收、污染小等优点，因此本研究采用的乙醇回流提取的方法最适合放大生产。在醇提取工艺研究中，以总黄酮的含量为指标，设计乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数4个因素进行正交试验，考察对总黄酮提取率的影响，最终选定了最佳的提取工艺条件。

3.2 药材性状的选择 黄蜀葵花药材醇提液浓缩静置后，提取浸膏上层有一层油状物，分析是由花托中的叶绿素及花蕊中的多糖、果胶等成分组成[14]。本研究通过试验对比发现未开放及半开放的黄蜀葵花药材醇提去油率较高，分析是由于未完全开放的花瓣将花蕊包裹，保留了较多的多糖及果胶成分，不利于有效部位的分离纯化。因此在对黄蜀葵花总黄酮有效部位分离纯化时，应优选完全开放的花进行提取，同时对药材的花托比例进行限定。

3.3 含量测定指标的选择 目前对黄蜀葵花药材含量测定的文献报道多为单独测定总黄酮有效部位或单独测定金丝桃苷、异槲皮苷等单成分含量[15-16]。本研究不仅对黄蜀葵花药材不同部位的总黄酮总量进行了测定，同时对总黄酮中含量及活性最高的指标成分金丝桃苷、异槲皮苷进行了定量分析，结果表明黄蜀葵花中总黄酮含量较高时，金丝桃苷和异槲皮苷含量也较高，二者呈一定相关性，更全面的评价了黄蜀葵花药材的质量，为进一步研究有效部位与单成分之间的相关性和药理药效的机理提供了数据支持。

3.4 不同开放程度药材含量分析 黄蜀葵花中总黄酮、金丝桃苷及异槲皮苷含量趋势为：黄色全开放花>黄色半开放花>偏绿色未开放花。全开放的黄蜀葵花，颜色为亮黄色，花瓣大而舒展，有效成分含量高，提取转移率高，去油率低；未开放的黄蜀葵花，花瓣卷曲呈螺旋状，由于其尚未开放即进行采摘，花朵接收的阳光光照不足，其外层花瓣呈浅绿色，有效成分含量偏低，提取转移率低；半开放的黄蜀葵花，其颜色为黄色，花瓣没有完全展开，有效成分的含量居于前两者之间。从上述结果可以看出，黄蜀葵花药材的质量与其开放程度密切相关，由于该花只有一天开放时间，因此采收时间宜在晴天的白天花朵完全开放后当天采摘，过早采摘未开放的花将影响药材的质量。在黄蜀葵花15个样品中，S1～S5样品颜色较其他样品偏绿，同时各成分含量较其他样品偏低，说明黄蜀葵花中黄酮类成分的含量可能与其颜色有一定的相关性，有待进一步研究。

3.5 结论 总黄酮、金丝桃苷和异槲皮苷作为黄蜀葵花中主要活性成分，其含量高低直接影响黄蜀葵花的内在质量及临床疗效。本研究以总黄酮有效部位、金丝桃苷及异槲皮苷和醇提转移率为检测指标，对不同开放程度的黄蜀葵花药材进行分析研究，结果表明，黄蜀葵花药材不同的开放程度对总黄酮、金丝桃苷和异槲皮苷的含量均有影响，亮黄色全开放花中总黄酮、金丝桃苷及异槲皮苷的含量最高。