两种猪伪狂犬gE抗体ELISA检测试剂盒效果评价

陈滢锴　张红云,2　彭小玉　陈海兰　王金子　齐豫川

两种猪伪狂犬gE抗体ELISA检测试剂盒效果评价

陈滢锴1张红云1,2彭小玉1陈海兰1王金子2,3齐豫川4

（1.广西大学，广西 南宁 530005；2.广西璞缔恩葳生物技术有限公司，广西 南宁 530007；3.广西民族大学海洋与生物技术学院，广西 南宁 530006；4.中国科技开发院广西分院，广西 南宁 530022）

目的：为了评估A、B两种猪伪狂犬gE抗体ELISA检测试剂盒的检测效果，为猪伪狂犬gE抗体ELISA检测试剂盒提供选择依据。方法：试验将12份待检血清样品进行检测并计算A、B试剂盒的符合率和阳性率；通过对3份留样血清样品进行梯度稀释、设置平行实验进行检测，评估两种试剂盒的重复性、灵敏度和稳定性。结果：用两种试剂盒检测，样品的阳性率均为33.3%，符合率为100%；通过稀释留样血清样品的检测和平行试验发现：用A试剂盒检测两份样品，检出显示阳性的最低稀释度分别为1∶64和1∶16；用B试剂盒检测2份样品，检出显阳性的最低稀释度分别为1∶32和1∶8。结论：两种试剂盒重复性好，均适用于临床样品的PRV gE抗体检测，但A试剂盒灵敏度高于B试剂盒，而B试剂盒稳定性更高且价格更低。说明生产实践中应对A、B试剂盒的重复性、灵敏度、稳定性和价格因素进行综合考量，合理选择性价比更高试剂盒。

猪伪狂犬病；gE抗体；ELISA检测；灵敏度比较

引言

伪狂犬病（pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）感染猪、牛、羊等多种家畜和野生动物引起的一种高度接触性传染病。猪是该病毒的主要天然宿主、贮存者和传播者[1,2]。猪被感染的典型临床特征是妊娠阶段的母猪出现流产，哺乳仔猪出现高热、神经症状，仔猪流产率高、死亡率高[3]，育成阶段的猪表现为体表皮肤瘙痒，出现疹块危及到猪群的健康成长。伪狂犬病在全球养猪业普遍存在[4]，我国自1947年首次报道该病以来，已有20多个省（自治区、市）流行过该病，并在许多猪场呈暴发性流行[5]，伪狂犬病是现代养猪业要面对的主要病原之一，对生猪养殖业造成的经济损失十分严重[6]。近年来，更有报道认为PRV可引起人眼内炎和脑炎[7-9]。这些发现表明PRV感染是一个潜在的公共卫生风险，不仅限于养猪业。因此，研究猪伪狂犬gE抗体ELISA检测试剂盒的效果对猪伪狂犬病的检测与净化刻不容缓。陈伟杰、董雅琴等研究者曾对市场上的一些PR gE抗体检测试剂盒进行了比较分析，给出了一定的建议。其中，陈伟杰等[10]侧重于对不同试剂盒之间检测结果的一致性进行评价，董雅琴等[11]侧重于比较分析各试剂盒敏感性、特异性以及试验结果的重复性与准确性。杨涛[1]、陆江[12]等均对进口试剂盒进行比较研究。段群棚[13]、宋诗川[5]等均采用进口试剂盒进行检测。目前没有研究对市场上广泛使用的外国和国产品牌的检测灵敏度、稳定性、符合率及价格等方面进行系统地比较分析，忽略了国产试剂盒的重要性。本研究从试剂盒的检测灵敏度、稳定性、符合率及价格等方面进行比较分析，为养猪生产实践中选择更合理PRV gE抗体ELISA检测试剂盒提供依据。

1　材料

1.1　血清样品

南宁市某规模养殖场送检的12份临床背景清楚的待检血清样品和实验室留样保存的3份血清样品。

1.2　试剂

A厂家生产的PRV gE 抗体试剂盒（批号为AT 069，阻断ELISA），简称A试剂盒；B厂家生产的PRV gE 抗体试剂盒（批号为EP 0621017，阻断ELISA），简称B试剂盒。

1.3　主要仪器

恒温培养箱（型号为DHP-9162），购自上海齐欣科学仪器有限公司；酶标仪（型号为F50），购自帝肯（上海）贸易有限公司。

2　方法

2.1　试验设计

2.1.1待检血清样品的检测

将12份待检血清按顺序编号，按照试剂盒说明书要求分别用A、B两种试剂盒进行检测，计算其符合率（指A、B试剂盒检测同一样品同时定性为阳性或阴性数量之和除以检测总数）和阳性率。

2.1.2留样血清样品的检测

3份留样血清样品经梯度稀释后用A、B试剂盒检测，共设置平行实验3次，对两种试剂盒的重复性和灵敏度进行评估；对3份样品不同稀释度的3个结果（OD值）计算变异系数（CV=平均值/标准差），再计算每个样品的平均变异系数，以衡量两种试剂盒的稳定性。

2.2　结果判定

计算公式：S/N值＝样品OD值/阴性对照OD值

A试剂盒判定标准：S/N值≤0.6为阳性，S/N值＞0.7为阴性，S/N值在0.6～0.7判为可疑。

B试剂盒判定标准：S/N值≤0.6为阳性，S/N值＞0.6为阴性。

3　结果与分析

3.1　待检血清样品的检测结果

用A、B试剂盒对12份待检血清样品的gE抗体进行检测，结果显示样品3、样品6、样品7、样品8四份样品均为阳性，其余样品均为阴性，阳性率均为33.3%（见表1）；12份样品中同时为阳性的样品有4份，同时为阴性的样品有8份，无可疑项，故两种试剂盒的符合率为100%（见表2）。

表1　A、B试剂盒对待检血清样品的检测结果

表2　A、B试剂盒对待检血清样品的检测结果的符合率

3.2 留样血清样品的检测结果

用A、B试剂盒检测三份留样血清样品，结果均显示样品1、样品3为阳性，样品2为阴性（见表3至表4）。用A试剂盒检测样品1和样品3，检出显示阳性的最低稀释度分别为1∶64和1∶16；用B试剂盒检测样品1和样品3，检出显阳性的最低稀释度分别为1∶32和1∶8；（见图1和图3）故判断A试剂盒检测灵敏度更高，A、B试剂盒均能有效检出样品2为阴性（见图2）。A、B试剂盒各稀释度的平均变异系数都小于10%，说明其重复性良好，B试剂盒各稀释度平均变异系数均小于A试剂盒，说明其重复性最好，稳定性最高（见图4）。

表3　A试剂盒对留样血清样品的检测结果（n=3）

注：S/N值取X±S，其中X为三次平行试验S/N值的平均值；S为三次平行试验S/N值的标准偏差。

表4　B试剂盒检测结果（n=3）

注：S/N值取X±S，其中X为三次平行试验S/N值的平均值；S为三次平行试验S/N值的标准偏差。

图1 样品1检测结果

注：S/N值低于0.6判定为阳性，下同。

图2 样品2检测结果

图3 样品3检测结果

图4　留样血清检测结果的变异系数比较

4　讨论

目前，国内基本上是通过PRV gE基因缺失疫苗配合gE-ELISA检测试剂盒来剔除野毒感染猪，并加强猪场生物安全措施、引种监测、严防新毒株的传入，开展猪伪狂犬病的控制与净化工作[14]。gE基因是PRV的非必需基因，PRV缺失gE基因后，病毒毒力降低，但不会影响病毒的复制扩增和免疫原性[15]，因此gE基因是PRV一个良好的标记基因，目前市面上广泛使用的PRV疫苗，就是利用这个原理，缺失了gE基因降低了PRV的病毒毒力，但保留了原毒株的免疫原性[16,17]，因此在疫苗免疫后检测不到gE抗体；而PRV所有野毒株有gE基因，在被PRV野毒感染的猪体内能检测到gE蛋白，这为利用分子生物学和血清学方法进行PRV 野毒感染和gE基因缺失疫苗鉴别诊断提供了条件[18]。国内大多猪场只使用gE基因缺失的伪狂犬疫苗，故利用gE抗体检测来区分养殖场是否被PRV野毒感染。

当前PR的传播给国内养猪业造成了巨大的经济损失，而对PR野毒的及时检出，是猪场制定有效治疗和防控措施的关键。由于PRV gE基因缺失疫苗被广泛应用，通过对猪血清中PRV gE抗体的检测，可判断猪场是否存在野毒感染。此方法也是目前猪场进行PR诊断和净化重要且有效的手段。目前检测gE蛋白特异性抗体的方法主要有病毒中和试验（VNT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、乳胶凝集试验（LAT）。其中，VNT因不适宜于大面积的临床诊断与筛查而难以在实际生产中[19,20]；LAT具有较高的可靠性，但其较复杂的操作方法也限制了它的广泛应用[21]。生猪养殖场普遍采用的是基于阻断ELISA原理的gE蛋白特异性抗体检测试剂盒，具有操作简单、通量高等优势，备受临床从业人员的青睐[22]。但各厂家的试剂盒在质量和价格上存在较大差异，因此，如何选择准确的诊断试剂盒是目前普遍存在的问题。

本试验通过对12份待检血清样品和3份留样血清样品的全面检测，发现两种试剂盒对待检血清样品的检出率均为33.3%，符合率为100%，均适用于临床样品的PRV gE抗体检测。但是通过稀释留样血清样品的检测和平行试验发现，A试剂盒的灵敏度高于B试剂盒，但B试剂盒稳定性更高且价格更低。此外，本试验A试剂盒符合率与杨涛等[1]结果相似，与其他厂家生产的试剂盒相比有较高的符合率，gE抗体阳性率33.3%与段群棚等[13]的检测结果相符；比宋诗川检测结果偏高，可能是本试验样品数量较少或与猪场间PRV防控水平差异相关，也可能是与gE抗体阳性率呈上升趋势有关[5]。陆江等[12]直接将A试剂盒的检测数据作为标准，评价其他厂家的试剂盒，表现出A试剂盒具有良好的检测效果。B试剂盒检测结果与董雅琴等的数据有所差别，可能是不同批次间重复性较差[11]。

5 结论

综上所述，A、B试剂盒检测结果高度一致，均可应用于临床检测。而A试剂盒是经过我国农业部注册的PRV进口诊断产品，灵敏度更高，同时其操作方法也列入了农业部的行业标准，质量经过了严格的检验，在国内和国际上都被高度认可；B试剂盒为常用国产诊断产品，在试剂盒成本上更具优势，且稳定性更佳，若要对PRV野毒抗体进行持续监测，就需试剂盒具备较好的稳定性，以保证监测数据的可靠性，这时应选择B试剂盒。若用于PR净化则建议使用灵敏度较高的A试剂盒，但A试剂盒成本更高，临床检测需综合考量。

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Effect Evaluation of Two ELISA Kits for Detecting gE Antibody in Swine Pseudorabies

Objective: To evaluate the detection effect of ELISA kit for gE antibody of swine pseudorabies A and B, and to provide a basis for selection of ELISA kit for gE antibody of swine pseudorabies. Methods: 12 serum samples were tested and the coincidence rate and positive rate of kit A and B were calculated; the repeatability, sensitivity and stability of the two kits were evaluated by gradient dilution of 3 retention serum samples and parallel test. Results: The positive rate of samples was 33.3% and the coincidence rate was 100% when tested with two kinds of kits; through the detection of diluted serum samples and parallel test, it was found that the lowest dilution of positive results were 1∶64 and 1∶16 respectively when two samples were detected with kit A; two samples were tested with kit B, and the minimum dilution of positive reaction was 1∶32 and 1∶8, respectively. Conclusion: The two kits have good repeatability and are suitable for the detection of PRV gE antibody in clinical samples. However, the sensitivity of kit A is higher than that of kit B, while kit B has higher stability and lower price. It indicates that the repeatability, sensitivity, stability and price factors of A and B reagent kits should be comprehensively considered in production practice, and a more cost-effective kit should be reasonably selected.

swine pseudorabies; gE antibody; ELISA test; sensitivity comparison

S828

A

1008-1151(2022)12-0039-04

2022-09-23

南宁市优秀青年科技创新创业人才培育项目（RC20190102）。

陈滢锴（1998－），男，四川宜宾人，广西大学在读硕士研究生，研究方向为动物疾病快速检测。

王金子（1982－），男，黑龙江齐齐哈尔人，广西民族大学海洋与生物技术学院副教授，博士，硕士生导师，研究方向为微生物资源利用；齐豫川（1991－），男，河南郑州人，中国科技开发院广西分院工程师，硕士，研究方向为分子生物学。