抗生素磺胺嘧啶和磺胺甲恶唑在土壤中的淋溶行为研究

胡双庆，张 玉,2，沈根祥*

1.上海市环境科学研究院，国家环境保护新型污染物环境健康影响评价重点实验室，上海 200233

2.华东理工大学，上海 200237

抗生素具有抑制或杀灭细菌的作用，被广泛用于人类和动物的疾病预防与治疗，也被作为营养物质的替代品用于饲料添加剂中，从而促进动物生长[1-3].但是，多数抗生素不能被人体和动物完全分解与吸收，会以母体化合物或代谢产物的形式存在于排泄物中，如在粪便和尿液中检出率为75%～90%[4].农业生产上畜禽粪污还田在多数国家都较常见，通过施用粪便有机肥或粪尿污水灌溉的方式，残留的抗生素也会进入农田土壤，危及微生物活性及其生态功能，进而影响微生物参与生态系统的过程，同时从分子遗传水平上改变环境中微生物的群落结构，致使致病细菌产生耐药性[5-6].残留在环境中的抗生素会在各级生物间累积放大，并通过食物链进入人体[7-9]，对生态环境和人类健康造成潜在威胁[10].

在众多抗生素中，磺胺类药物(sulfonamides，SAs)因其价格低廉、药效好、毒性小、适用性强等优点，常被用于畜禽养殖业[11].我国畜禽养殖业中SAs用量较大，且使用量逐年递增，Zhang 等[12]研究发现，2013 年猪、鸡养殖过程中使用的11 种SAs 总量分别达3 520 和2 450 t.磺胺嘧啶(sulfadiazine，SDZ)和磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole，SMX)是2 种常用的典型SAs，它们在环境中的检出率较高且残留量较大[12-14].与其他抗生素相比，SDZ 和SMX 的正辛醇-水分配系数较小且吸附能力较弱[15]，容易通过雨水冲刷、浸泡和渗滤等作用逐渐释放，并随水以可溶态在土壤中向下垂直迁移并污染地下水环境.

目前，对于农药和重金属在环境中的移动性已开展大量研究，但对于抗生素在土壤中的淋溶行为的研究较少，对其进行系统性和规律性探讨的研究较为鲜见[16-19].抗生素在环境中的垂直迁移性取决于自身、土壤理化性质以及环境条件等.因此，该研究通过模拟土壤柱淋溶试验，研究了2 种典型磺胺类抗生素−SDZ 和SMX 在不同表层土含量、淋溶液pH和有机质(即考虑粪便作为肥料进入土壤)影响下各土柱剖面的残留水平，并采用地下水污染指数表示抗生素淋溶迁移性的大小，预测其对地下水的潜在污染风险，以期为磺胺类抗生素的环境行为分析和生态风险评价提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 抗生素

2 种目标抗生素SDZ 和SMX 的分子结构和基本理化性质如图1 和表1 所示.SDZ 和SMX 均为酸碱两性分子，既有呈弱碱性的芳香伯胺，又有显弱酸性的磺酰氨基.pH 越低，SDZ 和SMX 阳离子形态占比越多；随着pH 的升高，SDZ 和SMX 以中性分子存在；pH 越高时，SDZ 和SMX 阴离子形态占比越多.

图1 2 种目标抗生素的分子结构式Fig.1 The molecular structural formulas of 2 target antibiotics

表1 2 种目标抗生素的理化性质Table 1 The physiochemical properties of 2 target antibiotics

1.1.2 供验土壤和牛粪

供试土壤采自上海市青浦区某水稻田的表层土(0～20 cm)，土壤为青紫泥(人为土纲，人为土成土亚纲，水稻土类，脱潜型水稻土亚类).土壤样品置于实验室中自然风干，然后研磨并过筛(<2 mm)以去除石块、沙砾和植物杂质.过筛后的土壤样品保存于自封袋中，放置在4 ℃冰箱以备用.供试牛粪采自上海市奉贤区某养牛场，处理和保存方法与土壤样品相同.供试土壤和牛粪中均未检出SDZ 和SMX，其基本理化性质如表2 所示.

表2 供验土壤和牛粪的基本理化性质Table 2 The physiochemical properties of the tested soil and cattle manure

1.1.3 试剂和仪器

SDZ 标准品、SMX 标准品和SMX-13C6内标物购自德国Dr.Ehrenstorfer 公司；甲醇、乙腈、甲酸均为HPLC 级，购自美国Tedia 公司；乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、氯化钙、硫酸、氢氧化钠均为分析纯，购自上海凌峰化学品试剂有限公司.试验用水为Milli-Q 超纯水.SDZ、SMX 和SMX-13C6标准品均用甲醇配制浓度为100 mg/L 的标准储备液，置于4 ℃冰箱避光保存.EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液的配制：称取柠檬酸12.9 g，磷酸氢二钠27.5 g，乙二胺四乙酸二钠37.2 g，溶于超纯水中并定容到1 L，用0.1 mol/L 的硫酸或氢氧化钠调节pH 至4.00±0.05，需使用当天配制.

抗生素定量检测分析仪器采用高效液相色谱串联质谱仪(Xevo TQ-Smicro，美国Waters 公司)，样品前处理仪器和其他仪器设备包括超声波清洗器(KQ3200E，昆山市超声仪器有限公司)、高速离心机(H1850，上海湘仪仪器有限公司)、低温真空冷冻干燥机(LDG-0.3C，上海昊博低温真空设备有限公司)、氮吹仪(Anpel 12 通道，上海安谱实验科技股份有限公司)、pH 计(S220，梅特勒-托多仪器有限公司)、电子天平(TW223L，日本岛津公司)、超纯水器(Milli-Q，美国Millipore 公司).

1.2 试验方法

1.2.1 淋溶试验

参考OECD 土壤柱淋溶试验方法[20]，按以下步骤进行：在有机玻璃柱(60 cm×5 cm)底部垫一张直径为5 cm 的滤纸，然后覆盖一层厚度为1 cm 的石英砂；将自然风干并过筛的供试土壤填入柱中，边填边敲打，并适度按压，以保证柱中土壤均匀、紧实；土壤柱填充完毕后(土柱总高度为50 cm)，计算装入土量，求得土壤密度，尽量保证每根柱内的土量相同；在土壤表面覆盖一层厚度为1 cm 的石英砂，再盖上一张直径为5 cm 的滤纸；用分液漏斗从土柱顶部加入足量的0.01 mol/L CaCl2溶液，用来饱和土柱(在重力作用下溶液将缓慢往下渗透，当有水滴从土柱底部流出时认为达到饱和)，静置2 d 使土柱内水分排至接近自然状态；将添加一定浓度抗生素的污染土(干质量10 g)均匀地平铺在土柱顶部，再次用0.01 mol/L CaCl2溶液(每天滴加200 mL，模拟100 mm 的日降雨量)淋溶，用锡箔纸包裹有机玻璃柱以防止抗生素光解，保持试验温度为20 °C；结束后从取样孔中取样(从底部往上每隔10 cm 为一个取样孔，共5 个)，将采集的土壤样品冷冻干燥，每份样品准确称取5 g (干质量)提取净化.

为探讨不同淋溶条件对抗生素迁移能力的影响，设置了如下试验处理组：①表层土抗生素含量试验.表层土SDZ 和SMX 含量分别为4、10、20 mg/kg.②淋溶液pH 试验.表层土SDZ 和SMX 含量均为4 mg/kg，用0.01 mol/L 的硫酸或氢氧化钠调节淋溶液pH 分别为3.00、5.00 和7.00.③有机质添加试验.表层土SDZ 和SMX 含量均为4 mg/kg，根据有机质含量将表层土分为3 种，即土壤组(无牛粪)、混合组(土壤和牛粪质量比为1:1)和粪便组(全部为牛粪).每组试验均设置3 个平行，淋溶3 d 后，取样测定每根土柱不同深度的抗生素含量.

1.2.2 样品提取与净化

准确称取5.000 g (干质量)土壤样品于30 mL 玻璃离心管内，加入10 μL 浓度为5 mg/L 的SMX-13C6内标物与土壤样品混合均匀，再加入20 mL 甲醇混合EDTA-Mcllvaine 缓冲液(体积比为1∶1)作为提取液，涡旋30 s 后超声萃取20 min，以3 000 r/min 离心15 min，将上清液转入500 mL 玻璃烧杯中，再重复提取2 次，合并3 次提取液并用超纯水稀释至500 mL，用玻璃棒搅拌混匀后经0.47 μm 玻璃纤维滤膜(Whatman GF/F)过滤去除细小颗粒状悬浮物后待用.

依次用5 mL 甲醇和5 mL 超纯水活化固相萃取小柱(Waters 公司Oasis HLB 小柱，6 mL/60 mg)，将上述提取稀释后的水样以3 mL/min 的速度过柱.上样完毕后，依次用5 mL 超纯水和5 mL 5%的甲醇-水溶液淋洗，再将小柱置于真空状态下干燥10 min，最后用10 mL 的甲醇以1 mL/min 的流速洗脱目标物至具塞玻璃离心管中.洗脱液在水浴条件(水浴加热不超过30 ℃)下用氮气吹干，得到残渣，再用70%的甲醇-水溶液定容至1 mL，超声5 min 后，经0.22 μm PTFE 针式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，上机待测.

1.2.3 仪器检测方法

采用Xevo TQ-Smicro 高效液相色谱串联质谱仪检测土壤样品中SDZ 和SMX 的含量.色谱柱为Symmetry C18 柱(50 mm×2.1 mm，5 μm)，流动相A为乙腈，流动相B 为0.5%甲酸-水溶液，梯度洗脱程序：0～1.5 min，流动相中乙腈含量保持在20%；1.5～4.0 min，乙腈含量从20%逐渐增至95%；4.0～6.0 min，乙腈含量保持在95%；6.0～10.0 min，乙腈含量从95%逐渐降至20%.色谱柱温为35 ℃，流动相流速为0.25 mL/min，进样量为2 μL.质谱为三重四级杆质量分级器，在电喷雾离子源正离子模式ESI+下选用多反应监测模式MRM 扫描方式进行检测(SDZ和SMZ 的母离子∶定量子离子∶子离子分别为251.01∶155.94∶64.98 和254.12∶155.96∶91.98).源温度为150 ℃，锥孔电压为30 V，毛细管电压为3.5 kV，脱溶剂气温度为500 ℃，脱溶剂气流速为1 000 L/h，碰撞气为高纯氮气.

采用内标法，以土壤作为样品进行加标回收检测，得到SDZ 和SMX 的加标回收率在79.92%～100.67%之间.其检测限、标准曲线和加标回收率等如表3 所示，标准曲线的R2均大于0.99，由于仪器检测方法的分辨率高且检测限低，因此可用来定量土壤样品中痕量的目标抗生素SDZ 和SMX.

表3 2 种目标抗生素的标准曲线、检测限和加标回收率Table 3 The standard curve,detection limits and recoveries HPLC-MS/MS detection of 2 target antibiotics

1.2.4 数据分析

数据为3 次平行试验的算术平均值，采用SPSS 25.0软件中Dunnett′s 多重检验进行不同处理组之间的差异分析，用不同字母表示显著性差异(P<0.05，n=3).试验结果由Origin 8.0 软件进行拟合.

抗生素的淋溶迁移性通过地下水污染指数(GUS)来模型模拟[21]，计算公式：

式中：GUS 为地下水污染指数；DT50为50%衰减时间，d；KOC为有机碳吸附常数，L/kg.

2 结果与讨论

2.1 表层土抗生素含量对SDZ 和SMX 淋溶行为的影响

当表层土SDZ 和SMX 含量分别为4、10、20 mg/kg 时，2 种抗生素的淋溶行为如图2 所示.由图2可见，SDZ 和SMX 在土柱各层中的含量随表层土壤抗生素含量的增加而增加，在供试土壤中这2 种抗生素均呈向下迁移的趋势，且淋溶结束后上层土壤中抗生素含量明显高于下层(P<0.05).当表层土抗生素含量为4 mg/kg 时，0～10 cm 土层中SDZ 和SMX 含量平均值分别为39.70 和37.11 μg/kg，分别占施药量的25.81%和24.12%；10～20 cm 土层中SDZ 和SMX 含量平均值分别为25.20 和23.40 μg/kg，分别占施药量的16.38%和15.21%；20～30 cm 土层中SDZ 和SMX含量平均值分别为15.70 和13.63 μg/kg，分别占施药量的10.21%和8.86%；30～40 cm 土层中SDZ 和SMX含量平均值分别为10.50 和9.30 μg/kg，分别占施药量的6.83%和6.05%；40～50 cm 土层中SDZ 和SMX含量平均值分别为7.60 和6.00 μg/kg，分别占施药量的4.94%和3.90%.由于SDZ 和SMX 的有机碳吸附常数均较低[14,22]，不易在土柱中保留，短时间(3 d)淋溶就会随淋滤液流失，由土壤表层迁移至下部，因此推测随淋溶时间的增加，SDZ 和SMX 会逐渐迁移至土柱下层，甚至到淋出液中.此外，与SDZ 相比，SMX在各层土壤中检出的含量更低，表明SMX 的淋溶性较SDZ 强.

图2 不同表层土抗生素含量下SDZ 和SMX 的淋溶行为Fig.2 Leaching behaviors of SDZ and SMX in soil columns with different antibiotic contents in topsoil

文春波等[23]研究发现，SDZ 在土壤环境中较难降解，因此不同土层SDZ 含量的变化主要由吸附和淋溶引起.由于SAs 吸附性能较差，在土壤中的持久性也较差，易随雨水冲刷向下迁移[18,24].Rabølle 等[25]开展了4 种抗生素的土柱淋溶试验，发现多数药物都保留在土柱上层，这是因为表层土壤有机质含量比下层高，吸附能力强，从而降低了抗生素向下迁移的能力.

当表层土抗生素含量增至10 和20 mg/kg 时，各层土壤中的SDZ 和SMX 含量分别为表层土抗生素含量为4 mg/kg 时的2 和4 倍，说明随着表层土抗生素含量的增加，各层土壤受污染的程度增加.但土壤中保留的SDZ 和SMX 含量略低于预测值，可能是在淋溶过程中土壤先快速吸附SDZ 和SMX，优先占据了能量较高的吸附位点，随着表层土抗生素含量的上升，吸附位点开始减少并逐渐趋于饱和，使得吸附率下降[26].范秀磊等[27]研究也发现，抗生素首先通过疏水分配作用和范德华力快速吸附在微塑料表面，然后再向颗粒内扩散，最后到达吸附平衡，扩散速率常数逐步减小.

2.2 淋溶液pH 对SDZ 和SMX 淋溶行为的影响

考虑酸雨对土壤中抗生素纵向迁移性的影响，设置淋溶液pH 分别为3.00、5.00 和7.00，SDZ 和SMX的淋溶行为如图3 所示.由图3 可见：SDZ 和SMX主要保留在0～20 cm 的土层中，当淋溶液pH 为3.00 时，0～20 cm 土层中SDZ 和SMX 含量平均值分别为86.64 和78.64 μg/kg，分别占施药量的56.31%和51.11%；当淋溶液pH 为5.00 时，0～20 cm 土层中SDZ 和SMX 含量平均值分别为77.88 和72.62 μg/kg，分别占施药量的50.63%和47.20%；当淋溶液pH 为7.00 时，0～20 cm 土层中SDZ 和SMX 含量平均值分别为62.60 和59.29 μg/kg，分别占施药量的40.69%和38.54%.到20 cm 以下土层，3 种淋溶液pH 下SDZ 和SMX 的迁移规律大致相同，其含量均低于17 μg/kg，不超过施药量的11%.土柱中2 种抗生素的含量由上至下均呈逐渐递减的趋势，且淋溶结束后上层土壤中的含量明显高于下层(P<0.05)，与已有研究中其他几种SAs 的淋溶规律[28]一致.

图3 不同淋溶液pH 下SDZ 和SMX 的淋溶行为Fig.3 Leaching behaviors of SDZ and SMX in soil columns irrigated by rainfall of different pH values

淋溶液pH 对土柱中抗生素的迁移能力有重要影响，pH 为3.00 和5.00 时，各层土壤中SDZ 和SMX 的含量均高于pH 为7.00 时，淋溶液pH 越低，上层土壤中保留的抗生素含量越高.由于多数SAs是水溶性的，土壤pH 会影响其离子化形态[29].在极酸性条件下，SDZ 和SMX 多以阳离子形态存在，且pH 越低SDZ 和SMX 阳离子形态占比越多，会发生离子交换或与土壤表面带负电荷的颗粒结合.pH 为3.00～5.00 时，大部分(超过90%)SDZ 和SMX 以中性分子存在，此时抗生素主要通过疏水性分配作用、氢键作用和范德华力被土壤吸附；pH 为6.00～7.00 时，中性分子的量减至10%，阴离子形态的量增至90%，但阴离子形态的抗生素和带负电荷的土壤颗粒表面会产生静电斥力，导致吸附作用受到抑制，从而减少吸附量[30-32]，而易于向下迁移.pH 为6.00～7.00 时，尽管中性分子含量较少，大部分抗生素以阴离子形态存在，但吸附量还是相对较大；虽然中性分子对总吸附常数的贡献明显大于阴离子形态，但决定吸附总量的是可被吸附的离子形态的量[33].此外，随着pH 的升高，土壤中有机官能团离解，土壤颗粒表面负电荷增加[32]，也导致土柱中SDZ 和SMX 的吸附量减少，易随淋溶液流失.

2.3 粪便添加对SDZ 和SMX 淋溶行为的影响

大部分抗生素通过畜禽粪便还田的方式进入农田土壤，该研究设置了3 组添加不同比例牛粪的土柱，其SDZ 和SMX 的淋溶行为如图4 所示.由图4 可见：0～10 cm 土层中土壤组(无牛粪)、混合组(土壤和牛粪质量比为1∶1)和粪便组(全部为牛粪)中SDZ 和SMX 含量范围分别为37.11～39.70、45.09～47.04 和48.83～51.12 μg/kg，分别占施药量的24.12%～25.81%、29.31%～30.58%和31.74%～33.23%；10～20 cm 土 层中3 组试验土柱中SDZ 和SMX 含量范围分别为23.40～25.20、29.99～35.76 和34.59～38.16 μg/kg，分别占施药量的 15.21%～16.38%、19.50%～23.24%和22.48%～24.80%；而在20～50 cm 土层，3 组试验土柱中SDZ 和SMX 的迁移规律大体相同，二者含量均低于16 μg/kg，不超过施药量的10%.

图4 粪便添加下SDZ 和SMX 的淋溶行为Fig.4 Leaching behaviors of SDZ and SMX in soil columns filled with different manure-applied soils

不论是否添加粪便有机质，3 组试验土柱不同深度的土层中均检测到2 种抗生素，并且淋溶结束后上层土壤中抗生素含量明显高于下层(P<0.05).由于粪便中DOC (溶解性有机碳)含量较高，粪便的添加增强了土壤对抗生素的吸附性[22].在0～20 cm 土层中，混合组和粪便组土壤中SDZ 和SMX 含量均高于土壤组，且粪便含量越多，上层土壤中保留的抗生素含量越高，向下迁移的能力就越弱.但在20～50 cm 土层，3 组试验土柱中SDZ 和SMX 的含量基本相同.研究[34]表明，猪粪DOM 和抗生素同时引入耕地土时，使得磺胺嘧啶、氟苯尼考、泰乐菌素和诺氟沙星四种抗生素的吸附量明显上升，这是累积吸附、共吸附、增溶作用与竞争吸附共同作用的结果.土壤表层添加畜禽粪便能够增强土壤的吸附能力，抗生素向下的迁移性会明显减小[35]，抗生素在土柱中的淋溶性与其吸附性相反，即在土壤中的吸附性越弱，越容易随淋溶液到达土柱下层，甚至被淋出土柱到淋出液中.

土壤有机质和pH 是决定土壤吸附能力的两个重要因素，对土壤中化学农药[36]以及抗生素的淋溶性也有一定的影响[16,19,37].但由于添加的表层粪便(混合组、粪便组)只占土柱总质量的0.38%和0.76%，加入粪便对总有机质含量影响较小，因此3 组试验中抗生素在下层土壤中的迁移规律大致相同，即使加入粪便，SDZ 和SMX 在土柱中仍具有较高的淋溶性，能够迁移至深层土壤.此外，尽管添加粪便使土壤pH 稍有升高，但仅对表层土壤起作用，对抗生素在整个土柱中的迁移规律未产生明显影响[38].

2.4 SDZ 和SMX 对地下水的污染风险

采用地下水污染指数(GUS)模型评价抗生素对地下水的污染风险，GUS 值越大，说明污染物的迁移性越强，进入地下水的可能性也越大[21,35]：当GUS 值<1.8时，污染物很难发生迁移；当1.8≤GUS 值<2.8 时，一定条件下污染物会发生纵向迁移；当GUS 值≥2.8时，污染物具有较高的迁移性.GUS 是由半衰期(DT50)和有机碳吸附常数(KOC)共同决定的，即抗生素的半衰期越长、吸附能力越强，其在土壤中越易保留，不易出现在淋出液中，反之越易淋出.

已有研究[22,39]发现，SDZ 和SMX 在供试土壤中DT50值分别为8.48 和13.68 d，KOC值分别为1.71 和1.21 L/kg，带入式(1)得出SDZ 和SMX 的GUS 值分别为3.50 和4.45，均大于2.8，说明这2 种抗生素在土壤中的淋溶迁移性均较强.模型模拟结果与淋溶试验结果一致，进一步表明SDZ 和SMX 对地下水存在潜在污染风险，并可能威胁环境安全和人体健康，因而需要引起更广泛的关注.

3 结论

a)畜禽粪污还田会给农田土壤带来抗生素污染，其中磺胺类抗生素SDZ 和SMX 在淋溶过程中均呈向下迁移的趋势，但淋溶3 d 时总体来看上层土壤中的含量明显高于下层土壤.

b)抗生素的淋溶行为受到表层土抗生素含量、淋溶液pH 和粪便有机质添加的影响，表层土抗生素含量增加时，会提高SDZ 和SMX 向下迁移的能力；淋溶液pH 越低或粪便有机质添加量越高时，土壤中保留SDZ 和SMX 的含量就越高，向下迁移的能力就越弱.

c) 通过模型模拟，SDZ 和SMX 的地下水污染指数分别为3.50 和4.45，表明二者在土壤中的淋溶迁移性均较强，对地下水的潜在污染风险不容忽视.