2型糖尿病患者皮肤晚期糖基化终末产物和血清肌肽酶-1与糖尿病微血管并发症的关系研究

杨光，徐新，张宇，许娟，蒋淑娟，夏莉，张洋，王贻坤，李忠胜，章诗琪*

随着全球糖尿病发病率的稳步上升，预计糖尿病严重并发症的发病率及其相关的医疗支出将同步增加。大多数糖尿病患者在病程中至少会出现1种并发症。糖尿病肾病（DN）和糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最常见的并发症，且是终末期肾病（ESRD）和失明的主要原因［1］，这些并发症的发生、发展机制尚未完全明确。

活性羰基（RCS）和活性氧（ROS）在晚期糖基化终末产物（AGEs）和脂氧化终末产物（ALEs）的形成中起着重要作用。正常生理条件下AGEs的生成量很低，随着年龄的增长AGEs在血清、皮肤、软骨和心包液中不断积累［2］。一些与年龄有关的疾病如神经退行性疾病和冠心病，已被证明与AGEs有关［3-5］。一种糖基化活性氧即甲基乙二醛（MGO）的形成加速了高血糖患者中AGEs的形成，这些患者组织中增加的AGEs和ALEs被认为是糖尿病并发症的关键递质［6-8］。多项研究表明AGEs可导致细胞外基质堆积、慢性炎症和细胞增殖受损［9-10］。

L-肌肽是一种具有多种生化特性的二肽，可在糖化或氧化应激环境下起组织保护作用［11］。一般情况下肌肽可以灭活活性羰基，减少AGEs的形成，此外还可以作为抗氧化剂减少氧化应激和脂质过氧化。在人体内，循环中的L-肌肽很容易被血清肌肽酶-1（CN-1）降解。血清CN-1活性和浓度在个体间差异很大，但总体上女性高于男性［12-13］。由于L-肌肽的保护作用，低水平的CN-1可能有利于组织中高浓度肌肽的维持，从而对糖化和/或氧化性组织损伤有更好的保护作用。

测量皮肤AGEs水平的金标准是皮肤活检后的生化测定，但皮肤自体荧光（SAF）作为一种非侵入性的、实用的评估皮肤AGEs水平的替代方法越来越受到重视［14-15］。研究显示，糖尿病患者和DN患者的皮肤AGEs水平升高，且与心血管疾病（CVD）有关，而与已知的心血管疾病危险因素无关［16-18］。目前为止，2型糖尿病患者组织中AGEs与血清CN-1浓度之间的相关性仍不清楚，本研究试图评估这种相关性是否存在以及AGEs和血清CN-1浓度与部分糖尿病微血管并发症〔DN、DR、糖尿病周围神经病变（DPN）及糖尿病周围血管病变〕的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2021年1—3月在安徽医科大学第一附属医院内分泌科住院的2型糖尿病患者134例为研究对象。纳入标准：年龄＞18岁。2型糖尿病的诊断参考WHO 1999年糖尿病的诊断标准，即：存在糖尿病症状（典型症状为多尿、多饮、多食和体质量减轻）且随机血糖≥11.1 mmol/L或空腹血糖≥7.0 mmol/L或口服葡萄糖耐量试验（OGTT）2 h血糖≥11.1 mmol/L，若无典型症状需再测空腹血糖和OGTT 2 h血糖1次予证实。排除标准：严重肾脏、心脏、肝脏疾病；恶性肿瘤；尿路感染或发热。本研究方案得到了安徽医科大学第一附属医院临床医学研究伦理委员会的批准（编号：PJ2020-15-17），患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集 收集患者的性别、年龄、身高、体质量、糖尿病病程、收缩压（SBP）、舒张压（DBP），并计算体质指数（BMI）=体质量（kg）/身高2（m2）

1.2.2 糖尿病微血管并发症及其他疾病发生情况收集DR：免散瞳眼底镜检查显示视网膜微血管瘤、出血、硬性渗出、软性渗出、视网膜新生血管等DR的特征性改变。

DN： 估 算 肾 小 球 滤 过 率（eGFR）＜60 ml·min-1·（1.73 m2）-1和 /或尿白蛋白 /肌酐比值（ACR）＞30 mg/g，持续超过3个月。ACR参考范围为＜30 mg/g，微量白蛋白尿和大量白蛋白尿分别为30≤ACR＜300 mg/g和ACR≥300 mg/g。

DPN：在排除其他原因的情况下，糖尿病患者出现周围神经功能障碍相关的症状和/或体征，并使用肌电图（JB-904BK，Nihon Kohden，日本）检查正中神经/尺神经/桡神经/腓神经传导速度以诊断DPN。

本研究糖尿病周围血管病变是指存在全身动脉粥样硬化，即血管彩超提示动脉中出现血栓以及斑块时部分患者可能会存在管腔狭窄、闭塞并导致远端肢体缺血，使用彩色多普勒超声（Xario 100，Toshiba日本）检测并确诊。

高血压：基于病历或在住院期间未使用降压药物非同日3次诊室收缩压≥140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）和/或舒张压≥90 mm Hg。

血脂异常：在正常饮食情况下，满足下列4项中任意1项，（1）总胆固醇（TC）≥5.18 mmol/L；（2）三酰甘油（TG）≥1.70 mmol/L；（3）高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）＜1.04 mmol/L；（4）低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）≥3.37 mmol/L。

卒中、冠心病发生情况根据既往医疗记录进行确定。

1.2.3 实验室检查指标收集 采用化学发光法检测空腹C肽（FC-P），采用全自动尿液分析仪检测ACR，采用高效液相法检测糖化血红蛋白（HbA1c），采用肾脏病饮食改良（MDRD）公式计算eGFR。

1.2.4 皮肤AGEs测定 由经过培训的护士使用DM Scan（AGEs无创检测系统，中国科学院合肥物质科学研究院研制）于患者左前臂掌侧的皮肤进行自体荧光检测以评估皮肤AGEs［19］，该装置使用近似紫外光（中心波长：370 nm，半高宽：15 nm） 照射皮肤并刺激皮肤AGEs的释放（波长范围420～600 nm），同时该装置在420～600 nm的波长范围内发射宽带光源照射皮肤以测量组织的光照吸收和散射。通过3×1光纤束在300～600 nm的波长范围内采用光谱仪测量皮肤的发射光，包括漫反射光和荧光。荧光强度与漫反射光强度的比值为最终记录的皮肤AGEs。所有测量在室温、黑暗环境中进行，没有可见的血管、瘢痕、皮癣形成或其他皮肤异常的正常皮肤上进行。每位患者的皮肤AGEs重复测量3次，取均值记录。

1.2.5 血清CN-1测定 患者入院第2天留取空腹静脉血5 ml，离心后取血清，采用ELISA试剂盒（CUSABIO，武汉，中国）测定血清CN-1水平。

1.3 观察指标 分析皮肤AGEs与血清CN-1的相关性，皮肤AGEs、血清CN-1与一般资料、糖尿病微血管并发症及其他疾病、实验室检查指标的相关性，探究皮肤AGEs、血清CN-1变化的影响因素。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，不符合正态分布的计量资料采用M（P25，P75）表示，计数资料以相对数表示；连续变量之间的相关性采用Pearson相关分析和Spearman秩相关分析；皮肤AGEs和血清CN-1的影响因素分析采用多元线性回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 134例患者中女57例，男77例；平均年龄（53.8±12.3）岁；平均BMI（25.3±4.2）kg/m2；平均糖尿病病程6.5（2.0，10.0）年；SBP（139.2±20.5）mm Hg，DBP （79.0±12.5）mm Hg。DR 13 例（9.7%），DN 38例（28.4%），DPN 56例（41.8%），糖尿病周围血管病变79例（59.0%），高血压61例（45.5%），血脂异常56例（41.8%），脑卒中15例（11.2%），冠心病9例（6.7%）。DN中ACR处于参考范围2例（1.5%），微量白蛋白尿26例（19.4%），大量白蛋白尿10例（7.5%）。

FC-P 0.9（0.6，1.4）μg/L，ACR 13.4（7.0，37.4）mg/g，HbA1c（9.1±2.5）%，eGFR（103.9±26.2）ml·min-1·（1.73 m2）-1。皮肤 AGEs（80.2±10.6），血清CN-1（6.9±3.4）μg/L。

2.2 各项指标与皮肤AGEs的相关性分析 相关性分析结果显示，性别、年龄、DR与皮肤AGEs呈正相关（P＜0.05），eGFR、CN-1与皮肤AGEs呈负相关（P＜0.05），其余指标与皮肤AGEs无相关关系（P＞0.05），见表1。

2.3 皮肤AGEs影响因素的多元线性回归分析 以皮肤AGEs为因变量（赋值：实测值），以表1中差异有统计学意义的变量为自变量（赋值见表2）进行多元线性回归分析，结果显示性别、年龄、DR是皮肤AGEs的影响因素（P＜0.05），见表3。

表1 各项指标与皮肤AGEs的相关性分析Table 1 Correlation analysis of clinical variables with skin AGEs in type 2 diabetes

表2 皮肤AGEs/血清CN-1影响因素的多元线性回归分析赋值Table 2 Assignment of factors potentially associated with skin AGEs and serum CN-1 in type 2 diabetes in multiple linear regression analysis

表3 皮肤AGEs影响因素的多元线性回归分析Table 3 Multiple linear regression analysis of factors potentially associated with skin AGEs in type 2 diabetes

2.4 各项指标与血清CN-1的相关性分析 相关性分析结果显示，年龄、DBP与血清CN-1呈正相关（P＜0.05），皮肤AGEs与血清CN-1呈负相关（P＜0.05），其余指标与血清CN-1无相关关系（P＞0.05），见表4。

2.5 血清CN-1影响因素的多元线性回归分析 以血清CN-1为因变量，以表4中差异有统计学意义的变量为自变量（赋值均为实测值）进行多元线性回归分析，结果显示年龄、DBP、皮肤AGEs均不是血清CN-1的影响因素（P＞0.05），见表5。

表4 各项指标与血清CN-1的相关性分析Table 4 Correlation analysis of clinical variables with serum CN-1 in type 2 diabetes

表5 血清CN-1影响因素的多元线性回归分析Table 5 Multiple linear regression analysis of factors potentially associated with serum CN-1 in type 2 diabetes

3 讨论

近年来大量研究显示AGEs参与糖尿病慢性并发症的发生、发展［6-10］。由于肌肽的亲核作用可以清除活性羰基从而防止AGEs的形成，因此组织中肌肽的浓度对于减轻糖尿病并发症可能是至关重要的。组织中肌肽浓度与多种因素相关，如组织中是否存在肌肽合成酶以及血清中肌肽水解酶CN-1的浓度和活性。本研究试图评估皮肤AGEs和血清CN-1水平之间是否存在相关性以及其与糖尿病微血管并发症的潜在关系。

本研究结果显示，性别、年龄、DR与皮肤AGEs呈正相关，eGFR、CN-1与皮肤AGEs呈负相关；多元线性回归分析结果显示，性别、年龄、DR是皮肤AGEs的影响因素。皮肤AGEs与年龄关系的既往研究结果显示，AGEs与年龄相关的疾病之间存在正相关［20］，本研究结果与之相似，这可能是由于衰老导致机体内氧化代谢产物堆积，从而促进AGEs生成增加，也可能是AGEs本身即可促进衰老有关［21］。在皮肤AGEs与DR的体内［22］和体外［23］研究中，皮肤AGEs和DR之间的关系已经得到证实。此外皮肤活检［24］或SAF［25］测量的AGEs已被认可为诊断DR的标准。AGEs可能是通过引发内皮功能障碍、促进促炎细胞因子和促血管生成因子形成、介导周细胞凋亡，进而使视网膜的神经和血管发生损伤，促进DR的发生、发展。目前，新型抗AGEs药物正在研究中，如肌肽、氨基胍、吡哆胺和苯基噻唑溴化物等，动物实验已经证实肌肽能够缓解糖尿病大鼠的DR［26］，但此类药物应用于临床则有待于未来进一步的研究。

有研究显示，皮肤AGEs与DN、DPN存在一定关系［24-25］，但本研究未发现皮肤AGEs与DN之间的联系。在相关性分析中，皮肤AGEs与ACR之间的P值为0.262，其原因可能为本研究中微量白蛋白尿或大量蛋白尿患者所占比例相对较小。本研究未发现皮肤AGEs与DPN存在相关关系，与YOSHIOKA［26］研究结果不同，这可能是由于用来定义DPN的标准不同。本研究中DPN是根据肌电图结果来确定的，而在YOSHIOKA［26］的研究中是根据神经病变症状来诊断，后者更倾向于感觉神经病变，而肌电图则覆盖感觉和运动神经病变。AGEs在不同神经病变之间是否作用不同则有待于进一步研究证实。

既往有关血清CN-1与糖尿病微血管并发症的研究显示，在2型糖尿病和肾功能受损的高加索人种患者中，血清CN-1浓度随着蛋白尿的增加而降低［27-28］。本研究未发现血清CN-1与ACR相关，亦未发现血清CN-1与其他糖尿病微血管并发症的关系，尽管已有研究表明肌肽在链脲佐菌素（STZ）诱导的DR［26］和DPN［29］模型中有保护作用，这一方面可能与人群不同有关，一方面可能与本文样本量较小有关，后期有待中国人群的大样本试验进一步研究。此外，本研究使用的是CUSABIO试剂盒测量血清CN-1，既往有研究使用RYSK-ELISA和ATLAS-ELISA方法测量血清CN-1［30］，不同的ELISA系统可能使用不同的CN-1抗体，使得血清CN-1测量值有所差异，这也需要进一步研究进行鉴别。

综上所述，皮肤AGEs、血清CN-1浓度与大部分糖尿病微血管并发症间无明显相关关系，但皮肤AGEs与糖尿病微血管并发症特别是DR的相关性大，因此皮肤AGEs更值得临床关注和进一步研究。

作者贡献：杨光、章诗琪提出研究构思与设计；夏莉、章诗琪进行研究指导；徐新、张宇、许娟、蒋淑娟、张洋、王贻坤、李忠胜参与数据收集、整理；杨光进行统计分析及撰写论文；章诗琪进行论文修订，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。