超声临界萃取天然产物活性成分分析与研究

张 玉

（海南科技职业大学，海南 海口 571126）

引 言

食品工业技术水平的不断提升，带给人们种类繁多的食品和药品，让人们的物质生活更加地富足，与此同时人们的生活也开始依赖这些食品和药品，因此，人们也越来越重视产品的安全性[1]。最近几年以来，国内外关于食品安全和药品安全的意外事件不断发生，使人们更加关注产品的主要组成成分，如哪些药品的组成是安全的，哪些是有害的，哪些食品的成分是完全无毒无害的[2]。如今，人们开始追求回归自然和健康养生，对于纯天然产物的需求不断地增多，给自然产物市场带来了商业化的改变。随着人们对关注的重点话题的深入研究，人们开始意识到，目前的技术水平不足以支撑天然产物分析与检测是制约该行业发展的主要因素之一，如何获取先进的处理技术直接关系到分析结果的优劣[4]。超声临界萃取天然产物活性成分分析与研究可为天然产物的分析检测提供代表性的样品，为后期的研究提供有利的理论支持。

利用超声临界萃取法获取天然产物的活性成分，是对天然产物提取和分离的过程[5]。农药是影响人类、环境和水系统健康的化合物，通过超声临界萃取法可以有效提取自然界中的农药残留化学物质，有效检测和测定化合物的微量水平浓度[6]。超声临界萃取法是利用超声波对天然产物的物理成分进行分离，再利用特殊的超声波模具实现对萃取物的提取。超声波只能在均匀的介质中才能实现定向地传播，当超声波的频率变高时，说明它的衍射能力逐渐变差[7]。采用超声辅助提取技术，通过振荡波的形式对天然产物的活性成分进行分离，可以有效从天然原料中提取活性成分[8]。天然产物中的活性成分十分复杂，采用高效液相色谱法通过超声波萃取天然产物活性成分并进行分析研究[9]，对于超声临界萃取法在各个领域的应用具有重要的现实意义。

1 实验部分

1.1 实验材料与试剂

选择腊梅鲜花作为实验材料，利用超声临界萃取法将腊梅鲜花中的活性物质萃取出来。实验用的腊梅鲜花采摘于竹山县，将采摘的鲜花清洗去杂，放在低温的条件下保存，等待后期使用。

实验所用试剂：HCl 和H2SO4（分析纯），化学科技(武汉)有限公司；苯酚、冰醋酸、氯仿、无水乙醇和三氯甲烷（均为分析纯），瑞威尔生物科技有限公司。

1.2 实验仪器及设备

实验过程中使用的主要仪器设备如表1 所示。

表1 实验仪器设备Table 1 The experimental instruments

1.3 实验方法

1.3.1 样本的制备与处理

取出低温条件下保存的腊梅鲜花，开始脱水处理，保持含水量为40%以下，相关参数设置为：压力35MPa、萃取时间3.5h、温度45℃，经过超声临界萃取后获取腊梅花干和初级精油。采取膜浓缩的方式对初级精油进行蒸馏、分离等程序的二次加工，得到浓缩液、液态精油和固态精油。

当完成超声临界萃取之后，迅速将腊梅花干取出来，摊放在一个平面上烘干处理，去除花干表面的水分磨碎处理[10]，放置在零下20℃的环境下储存，准备测试。

精油浓缩液处理：在萃取物中提取200mL 精油浓缩液，放入500mL 样品瓶中，取200g 硫酸钠固体放入样品瓶中，在5℃的环境中静置1d，将上层清液转移到20mL 的萃取瓶中，密封保存在5℃的环境中，等待测试。

液态精油处理：将100μL 的液态精油放入20mL的萃取瓶中，与10mL 二氯甲烷漩涡处理30s，待两者充分混合之后，密封保存[11]，放在5℃的环境中等待测试。

固态精油处理：将50g 固态精油放入滤筒中，将300mL 二氯甲烷与固态精油混合，并对其进行提取，直到无色为止，将提取得到的混合液转移到500mL的量瓶中，密封保存，在室温环境下存放等待测试[12]。

1.3.2 超声临界萃取精油的活性成分分析

经过预实验，得到三种腊梅精油的色谱条件，分别为：精油浓缩液色谱条件：总流量为6.3mL/min，分流比为2.0，以10℃/min 的速度将温度升高到90℃，接着以3℃/min 的速度将温度升高至110℃，5min后以相同速度将温度升高至177℃，维持7min[13]。

液态精油色谱条件：30m×0.25mm×0.25μL 的色谱柱，进样方式和温度分别为液体进样和230℃，总流量为14.5mL/min，分流比为11.0，以15℃/min的速度将温度升高到70℃，接着以2℃/min 的速度将温度升高到80℃，保持7min，再以1℃/min 的速度将温度升高到84℃，持续1min，最后在10℃/min速度下，将温度升高到160℃，保持2min[14]。

固态精油色谱条件：30m×0.25mm×0.25μL 的色谱柱，载气选择高纯氦气、流速为1mL/min，柱箱温度40℃，进样方式和温度分别为液体进样和230℃，总流量为19.9mL/min，分流比为15.5，以15℃/min的速度将温度升高到120℃，再以1℃/min 的速度将温度升高到146℃，保持4min，最后以3℃/min 的速度将温度升高到270℃，保持10min[15]。

2 结果分析

2.1 蜡梅花干与鲜花基本化学成分的对比分析

利用超声临界萃取法，对腊梅花干的基本化学成分进行萃取，并与鲜花的基本化学成分进行对比，得到下表。

表2 腊梅花干与鲜花主要成分含量Table 2 The contents of main ingredients of the dried and the fresh flowers of chimonanthus praecox

由上表可以看出，腊梅花干与鲜花的基本化学成分进行对比，除了都存在的灰分和粗纤维的占比有明显的增高，其他的化学成分的占比都有所下降。其中，多酚的占比和下降比例最大，由14.96mg 下降至8.27mg，同比减少了44.71%；并且腊梅花干中的氨基酸也有明显的下降，由138.71mg下降至81.25mg，同比减少了41.42%；可溶性总糖也有明显的下降，同比减少了30.03%，蛋白质的占比下降最多，由原有的，283.62mg 下降至194.38mg，同比减少了89.24mg，占比下降了31.46%；还原糖和总黄酮都有明显的下降为21.33%和13.88%；粗脂肪的成分变化不大，由72.94mg 减至62.87mg，减少了13.81%；多糖只有细微的变化，由19.24mg 减至19.00mg，减少了1.25%。超声临界萃取后的蜡梅花干，虽然其基本化学成分都有一定的下降，但腊梅花干的主要化学成分组成变化不大，使得进行超声临界萃取后的蜡梅花干仍具有大量的可利用成分。

对腊梅花干和鲜花进行基本化学成分超声临界萃取过程中，其基本成分存在差异的原因，可能是在对鲜花进行超声临界萃取的过程中大部分的活性成分转化到精油中。其中的蛋白质和可溶性糖的减少比例不大，对原本的化学成分构成影响不大。而灰分和粗纤维含量在超声临界萃取过程中含量变多，可能是对这两种活性成分进行萃取的过程中，不易溶于精油中，造成萃取后的化学成分含量增加。

2.2 超声临界萃取天然产物活性成分分析结果

对预处理后的三种精油进行分析，得到不同状态下精油的总离子色谱图，如图1 所示。

图1 不同状态下精油的总离子色谱图Fig. 1 The total ion chromatograms of essential oils in different states

根据图1 可知，精油浓缩液、液态精油和固态精油总离子色谱图由许多峰组成，这些峰出峰先后是按照色谱出峰先后顺序进行排列的，具有不同的离子流强度。总离子色谱图的峰即为蜡梅花精油的活性成分化学物质，离子强度越高证明化学物质越单一，纯度也越高。在15s，28s 和43s 时精油浓缩液提取纯度较优，15s 和43s 时液态精油提取纯度较优，32s 和43s 时固态精油提取纯度较优。

综上所述，为了对超声临界萃取天然产物活性成分进行分析，在时间为43s 时提取萃取后的精油浓缩液、液态精油和固态精油作为分析对象，由此得到了256 种腊梅花精油的活性成分化学物质。其中，腊梅花精油浓缩液的活性成分种类为95 种，腊梅花液态精油中的活性成分有54 种，腊梅花固态精油中活性成分的种类为107 种。活性物质种类组成：脂类物质58 种，醛类物质32 种，烷烃类物质25种，醇类物质23 种，其他物质54 种。对三种精油的活性成分进行分析，结果如图2 所示。

图2 腊梅精油物质种类及含量Fig. 2 Types and content of winter plum essential oil

根据图2 的结果，对腊梅精油中部分组分的香气特征进行了分析，如表3 所示。

表3 腊梅精油中部分组分的香气特征Table 3 The fragrance characteristics of some ingredients in chimonanthus praecox essential oil

基于表3 的特征，分析了腊梅精油经过超声临界萃取之后的天然产物活性成分。

2.2.1 醛类物质

超声临界萃取后得到的醛类物质，其活性成分中化学物质占比较高，能够与自然界的物质发生化学反应，转化为其他物质，所以超声临界萃取后的天然产物中的醛类物质含量较少。萃取之后含有的醛类物质的精油，具有特殊的香味，是构成天然产物中香味的主要化学物质。3 种精油共检测出32 种醛类物质，精油浓缩液中醛类物质的含量最少，含有7 种，含量2.15%，其中包括：3- 苯基-α- 甲苯基腙丙烯醛0.29%，苯乙醛0.14%；液态精油中的醛类物质含量占有10 种，含量8.95%，其中包括：壬醛3.94%、庚醛2.25%；固态精油中含有的醛类物质占有量最高，共有15 种，含量15.53%，其中包括：硬脂醛4.13%、壬醛7.97%等。庚醛具有较好的化学活性成分，可应用于香水和化妆品中；硬脂醛具有多种香味，可应用于多种调味料中；低浓度的硬质醛具有水果香，可以用作食品的调香成分。

2.2.2 烷烃类物质

超声临界萃取后的烷烃类物质，其活性成分中的化学成分较稳定，其中含有的碳原子活性较低，不易与其他化学物质相溶。低碳原子是一种具有可燃性的特殊气味气体，当碳原子数量增多时，会由气体转化为固态。3 种精油共检测出30 种烷烃物质，其中：精油浓缩液烷烃5 种，含量2.04%；液态精油烷烃10 种，含量3.42%；固态精油烷烃15 种，含量4.10%。超声临界萃取过程中，精油形态发生变化，烷烃内含碳原子的数量不断增多，由于本身具有特殊气味且具有刺激性，浓度过高会对人体产生危害，对精油有副作用，需要控制其含量，并利用超声临界萃取法对其进行分离。

2.2.3 醇类物质

醇类物质具有特殊的香气，是植物精油中香气定位的主要组成。其命名原则是由碳原子数决定的，其活性成分的物化性质由羟基数决定。精油浓缩液含有42 种，含量27.43%，其中包括顺-Α,Α-5- 三甲基-5- 乙烯基四氢化呋喃-2- 甲醇16.42%，（E）-2,6- 二甲基-3,7- 辛二烯-2,6- 二醇6.58%等多支链醇；液态精油含有11 种，含量6.59%，其中包括芳樟醇、桉油烯醇、Α- 毕橙茄醇等链状萜烯醇；固态精油含有27 种，含量8.10%。液态精油中含有的芳樟醇，不仅具有玫瑰木的香气，还具有镇痛和抗菌等诸多药理活性成分，是目前应用最广泛的精油活性物质之一。精油浓缩液内含有的香叶醇，具有玫瑰花的香气，是生产维生素E 的主要原材料；固态精油中含有的豆甾醇，由于其本身的特性，主要被应用在食品等方面。

2.2.4 脂类物质

脂类物质对精油的香气具有一定的影响，部分不溶于水和任何溶剂，主要成分是脂肪酸和醇发生化学反应后的衍生物。3 种精油共检测出32 种脂类物质，精油浓缩液含有8 种，含量1.47%；液态精油含有10 种，含量4.31%；固态精油含有14 种，含量7.91%。进行超声临界萃取后的脂类物质大多呈液体状，且具有一定的香气，如：十八酸乙酯、十六酸乙酯等；也有一部分脂类物质呈气体状，且具有特殊香味，如2- 甲基戊酸乙酯具有清甜果香味道，酸香叶酯类有玫瑰、水果清香气味；十二酸苯甲酯具有淡脂蜡清香。脂类物质大多具有化学香气，因此在工业香料中被广泛地应用。

3 结束语

本文进行了超声临界萃取天然产物活性成分的分析与研究，以腊梅鲜花为研究对象，采用超声临界萃取法获取腊梅鲜花的活性成分。利用膜浓缩的方式对经过超声临界萃取后获取的初级精油进行二次加工，采用离心分离得到浓缩液、液态精油和固态精油三种不同状态的腊梅花精油产物。萃取后的天然产物在43s 时提取纯度较优，通过分析发现腊梅鲜花的天然产物活性成分主要为醛类物质、烷烃类物质、醇类物质和脂类物质。其中，由于腊梅鲜花活性成分中的羟基数较高，所以醇类物质占比为42.12%，活性成分中的醛类物质会与自然界物质发生化学反应转化为其他物质，所以醛类物质占比为26.63%，脂类物质主要是化学反应后的衍生物，占比为13.69%，烷烃类物质由于其化学成分较稳定，所以占比较低为9.56%。通过本文的研究可以证明超声临界萃取可以有效获取天然产物活性成分，对后续的超声临界萃取方法研究提供了理论支持。