啮齿类动物类风湿关节炎模型概述

李宝莹 运晨霞

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种发病原因多样、发病机制复杂，临床表现以关节持续性炎症和不可逆的骨关节破坏等为主要特征的自身免疫性疾病[1]。有研究表明，RA发病关键的风险因素是遗传易感性，其中主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)决定着机体免疫应答和免疫稳态的相互关系，在自身免疫病的发生中起着重要的作用[2]。人类MHC被称为人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)复合体，HLA-Ⅱ类基因的DR区与RA的易感有关，其中HLA-DRB1基因是RA已知的易感基因[3]。通过检测具有HLA-DRB1基因的RA患者对早期免疫抑制治疗有积极的作用[4]。

为深入开展和了解RA的致病过程，RA动物模型是必不可少的工具。啮齿类动物因其成本低、遗传背景明确和操作方便等优点而得到广泛应用。目前常选啮齿类中的大鼠和小鼠作为模式动物，本文就5种常用刺激剂诱导的啮齿类动物RA模型的特征、不同品系的大鼠、小鼠对刺激剂的易感性及动物模型构建时需要注意的关键问题进行概述。

一、佐剂诱导性关节炎(adjuvant induced arthritis, AIA)模型

佐剂可分为弗氏完全佐剂(complete Freund′s adjuvant, CFA)和弗氏不完全佐剂(incomplete Freund adjuvant, IFA)，两者主要区别在于CFA添加了热灭活的结核杆菌。用 CFA制备AIA模型时，由于结核杆菌含有与关节滑膜上糖蛋白分子结构相似的分子结构，可诱发交叉免疫反应，激活T淋巴细胞过度增殖并攻击关节软骨中的C抗原成分，产生大量的肿瘤坏子因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素(interleukin,IL)-1β等炎性细胞因子导致持续性炎症发生，如坏死性肉芽肿[5]。用IFA制备AIA模型时，由于佐剂缺乏结核杆菌细胞壁成分或其他含有多肽成分，诱导的关节炎是慢性、关节特异性的，受T淋巴细胞和MHC基因调节。不同的是，CFA中含有热灭活的结核杆菌能诱导强烈的偏向Th1型的细胞免疫应答；IFA主要引起体液免疫应答，偏向Th2型反应。

本模型的造模方法是通过将佐剂注射到动物的尾根部来刺激激活远端四肢等关节炎症，由于注射部位远离发生炎症的部位，可完全排除注射刺激导致的非特异性炎症的干扰[6]。动物发病时炎症首先出现在注射部位，继发在身体其他部位出现关节的肿胀、足趾红肿且进行性加重导致行动不便等现象，病理表现可见滑膜增殖、淋巴细胞浸润和软骨退化等改变，这些表现与人RA相似。

在动物选择方面，较多选用大鼠，大鼠在构建AIA模型时受遗传背景中的MHC和非MHC基因控制，因此了解不同品系大鼠的遗传背景有助于提高AIA模型构建时的易感性。一般AIA模型构建时多采用Wistar、LEW(Lewis)和SD(Sprague-Dawley)大鼠，诱导10～14天可观察到关节炎的症状。但造模过程中大鼠的细胞免疫应答方面出现明显异常，而体液免疫应答不明显，这与RA患者大多表现为体液免疫应答与细胞免疫应答方面皆异常的表现有明显区别，是AIA模型的不足之一。小鼠也可经CFA诱导成AIA模型，但小鼠AIA模型病程持续时间较短。

二、胶原诱导性关节炎模型

Trentham等[7]利用Ⅱ型胶原蛋白免疫小鼠诱导产生了自身免疫性关节炎，因其许多与人RA相似的病理和免疫学特征而被广泛研究。临床研究表明，血清中抗天然Ⅱ型胶原蛋白抗体具有软骨降解的作用，与关节炎侵蚀损害程度有关。Ⅱ型胶原蛋白可从多种动物(大鼠、小鼠、牛、人、猪和鸡)中获得，不同种属间Ⅱ型胶原蛋白分子结构存在保守性，导致不同种属来源的Ⅱ型胶原蛋白能与自身抗体发生交叉反应[8]。

本模型在制备时常将Ⅱ型胶原蛋白乳化在CFA或IFA中，对易感的啮齿类动物(大鼠和小鼠)进行皮内免疫，Ⅱ型胶原蛋白进入体内后会经抗原递呈细胞加工、分解成多个多肽片段被MHC-Ⅱ类分子提呈给T淋巴细胞，T淋巴细胞活化后产成大量的炎性细胞因子引发CIA的病理进程[9]。同时，活化的T淋巴细胞可辅助B淋巴细胞活化分泌IgM型Ⅱ型胶原蛋白抗体，该抗体与Ⅱ型胶原蛋白形成免疫复合物沉积在关节滑膜部位，激活补体系统进一步使炎性细胞活化从而引起关节滑膜的炎症和软骨的损伤，动物通常在免疫1～2周后就开始出现关节的肿胀[10]。免疫过程具体分为两个阶段，第1阶段注射Ⅱ型胶原蛋白与CFA混合物；第2阶段注射Ⅱ型胶原蛋白与CFA混合物，炎症表现较为强烈；若采用Ⅱ型胶原蛋白与IFA混合物则骨侵蚀破坏更明显。后期炎性反应开始逐步减弱或消退时可进行再次免疫延长炎症。不同的是，第2阶段的加强免疫大鼠多选择在7～10天，小鼠多选择在第21天左右进行[11]。

胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型在免疫学及病理学上的变化与人RA有一些共同的临床和组织病理学特征，如关节肿胀明显，关节病理染色可观察到增殖性滑膜炎以及侵蚀性血管翳等炎症特征，体内可检测到抗Ⅱ型胶原蛋白抗体、皮肤迟发型超敏反应和关节降解表现[12]。

在动物选择方面，大鼠在构建CIA模型时多选用鼠龄7～8周、对CIA高度易感的SD、Wistar、BB(Bio-Breeding)、LEW、DA(Dark Agouti)等，其中在CIA研究中雄性大鼠占78.69%[13]。不同的是，同源性大鼠Ⅱ型胶原蛋白易诱导DA大鼠发生多发性关节炎，异源性鸡Ⅱ型胶原蛋白能诱导DA、BB、LEW等品系大鼠发生较强的炎性反应[14]。小鼠CIA模型多选用鼠龄7～8周、品系为DBA/1、BALB/C、C57BL/6和B10.RIII的小鼠和异源性Ⅱ型胶原蛋白来诱导。DBA/1小鼠和B10.RIII小鼠因拥有的H-2q和H-2r基因，使其易受到T淋巴细胞的抗原识别导致CIA敏感度很高，两者皆对牛和猪来源的Ⅱ型胶原蛋白较敏感[15]；不同的是，DBA/1小鼠对鸡Ⅱ型胶原蛋白可诱导较强的血清反应，B10.RIII小鼠对鸡Ⅱ型胶原蛋白反应较差[16]。BALB/C小鼠对牛来源的Ⅱ型胶原蛋白有反应，C57BL/6小鼠对鸡来源的Ⅱ型胶原蛋白产生T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫。相关研究表明，对CIA诱导反应敏感的大鼠比小鼠更早出现关节炎症状，T细胞活化持续时间更长使得炎症发生率和严重程度更大[17]。

三、链球菌细胞壁诱导的关节炎模型

许多细菌细胞壁肽聚糖成分已被证实具有促炎活性，可直接或间接刺激或调节免疫，诱导啮齿类动物发生关节炎。针对链球菌细胞壁特异的抗体反应以及软骨和骨骼的破坏依赖于Toll样受体(toll-like receptor,TLR4)通路，急性炎症阶段，链球菌也可以通过TLR2通路直接激活巨噬细胞，导致针对链球菌片段的先天免疫反应；在慢性期，链球菌首先启动特异性B淋巴细胞和T淋巴细胞反应的发生，接着激活适应性免疫反应[18]。

本模型在制备时将链球菌细胞壁成分肽聚糖多聚糖水悬液单独腹腔注射于易感品系体内，24h 即出现急性期关节肿胀，2 周左右出现慢性炎性反应，关节肿胀逐渐加重，至 4 周时趋于稳定，并持续数月，成为严重的侵蚀性关节炎。现研究认为急性期是胸腺非依赖性的炎性反应，而慢性期则是一种胸腺依赖性的特异性免疫应答过程，并且这种特征性的波动期与 RA 患者相似。这个慢性阶段与在受累关节高水平的炎性细胞因子、生长因子、金属蛋白酶、循环氧化酶及氧化氮的产生有关[19]。链球菌细胞壁诱导的关节炎(streptococcal cell wall arthritis, SCWIA)模型组织学和放射学结果显示有一段时间的急性渗出期，随后是侵蚀性滑膜炎，炎症严重程度与T淋巴细胞、B淋巴细胞和单核细胞的激活状态有关。与人RA比较，该模型滑膜增殖、炎性细胞渗透、对称关节受累和复发性炎症表现相似，但该模型缺乏高滴度的类风湿因子(rheumatoid factor, RF)，而且没有类风湿结节的形成[20]。此外，该模型对治疗人类RA的药物金制剂和青霉素的反应差。因此该模型用于研究RA仍有一定欠缺。

在动物选择方面，大鼠SCWIA模型的易感性与激素的分泌有关，其中雌性LEW大鼠的SCWIA发生率几乎为100%，而雄性LEW大鼠、MHC相容雄性、雌性Fisher(F344/N)、WKY、BUF和其他品系相对耐药，在暴露于链球菌细胞壁后不会发展为较严重的疾病[21]。小鼠SCWIA模型常用BALB/c、DBA/1品系小鼠在膝关节内一次或多次注射链球菌细胞壁碎片使关节敏感，首先出现急性关节炎，1周内痊愈，经反复注射导致慢性关节炎。

四、软骨寡聚基质蛋白诱导关节炎模型

软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, COMP)是一种五聚体糖蛋白，主要存在于软骨、肌腱、滑膜、气管、半月板关节软骨中，与软骨蛋白结合的抗体存在于早期RA患者的血液和滑液中，因此利用该蛋白可诱发高发生率的严重关节炎，同时伴有强烈的自身抗体反应，并确保只涉及自身免疫过程[22]。

本模型在制备时用天然和变性的COMP在IFA(不完全弗氏佐剂)中免疫可诱导大鼠的严重关节炎，溶解的COMP制剂用等量的IFA乳化，在大鼠尾巴底部进行皮内注射。在严重关节炎的情况下，COMP在组织侵蚀期间从软骨中释放出来。这是COMP的一个有趣的特征，这使它成为RA中关节炎的生物学标志物。慢性关节炎的大鼠在用低分子量佐剂降植烷的诱导下也会释放COMP，血清中的水平与侵蚀性关节炎的发生密切相关[23]。与CIA模型比较，COMP诱导关节炎模型具有一定的优势，关节炎的发病是突然的，其特征是出现红斑和前后爪肿胀。在脚趾关节远端观察到关节炎，并在几天内同时在脚踝/腕关节发作。在严重的情况下，可以看到其扩散到跖骨/掌骨区域以及关节和脚趾。

在动物选择方面，大鼠COMP诱发关节炎模型构建时，主要易感品系是DA和LEW；COMP诱发小鼠关节炎模型时常用C57BL/6小鼠，发病与MCHⅡ类肽识别有关，T淋巴细胞对非自身COMP的反应促进了关节炎的诱导[24]。与人RA比较，用COMP诱导的RA模型有利于研究关节炎的慢性发展和自身免疫反应的表位扩散和骨侵蚀，可作为研究关节炎发病机制的替代模型。

五、降植烷诱导关节炎模型

降植烷(pristane)诱发的关节炎是通过刺激B淋巴细胞合成IgM、IgA型RF，同时RF与降植烷形成免疫复合物被吞噬细胞吞噬，转变为炎性细胞浸润滑膜，这种受到T淋巴细胞和MHC基因调节的慢性特异性关节炎的模式使得PIA模型成为研究炎症性关节疾病机制的重要工具[25]。

本模型在制备时注射降植烷在动物腹膜或皮内，2～3周内炎症局限于关节，大鼠6～8周成为慢性复发性疾病；小鼠2～10个月才开始发生关节炎症。PIA模型造模过程虽然较长，但关节炎症呈慢性反复进行性加重，病理变化包括滑膜增殖、中性粒细胞浸润、骨膜炎、软骨侵蚀和进行性边缘侵蚀，血清方面也可检测到RF、抗热休克蛋白抗体以及Ⅱ型胶原，这些改变与人RA较为接近，因此，该模型非常适合应用于慢性复发炎症的长期研究以及治疗干预，尤其是T淋巴细胞活化相关途径导致的关节炎。

在动物选择方面，大鼠降植烷诱导关节炎(pristane induced arthritis, PIA)模型常用LEW大鼠，发生率较高，红肿最为明显，但模型发病时间相对较晚，且不同的个体造模结果差异较大，但在急性期，血清还可检测到RF和IL-6，与人RA十分相似，但炎症消退后病情仍反复发作[26]。小鼠PIA模型常用BALB/c小鼠，以慢性发展为特点，关节炎症肿胀程度较轻，一般经初次注射后还需再次注射等量降植烷后，10天左右才出现关节炎，70天左右才能观察到关节肿胀[27]。

需要说明的是，每一种啮齿类动物RA模型在发病机制、临床表现仅可模拟人RA疾病的一部分，并不能还原人RA发病的整个概况。模型的选择取决于待研究疾病的阶段和待解决的问题。合适的动物模型在构建时需根据研究的目的、动物的遗传背景、刺激剂等方面进行选择，以保证动物模型发病特点贴合研究目的，为RA的研究提供良好的实验工具。