木瓜、酒木瓜、光皮木瓜的HPLC指纹图谱鉴别

陈建真， 敖志辉， 陈 彬， 笈文娜， 吕圭源

(1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053；2.浙江省中医院，浙江 杭州 310006)

木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomelesspeiosa(Sweet) Nakai的干燥近成熟果实，味酸性温，归肝、脾经，具有舒筋活络、和胃化湿的功效，用于治疗湿痹拘挛、腰膝关节酸重疼痛、暑湿吐泻、转筋痉挛、脚气水肿[1]。临床上木瓜多经炮制后使用，如酒制品具有引药上行、增强活血行气止痛等作用。木瓜种类繁多，主要有皱皮木瓜、光皮木瓜2大类，前者为木瓜的主流商品，后者为木瓜的习用品或混用品，为同属植物榠楂Chaenomelessinensis(Thouin) Koehne的干燥成熟果实[2]。由于传统用药习惯的影响，市场上常有将光皮木瓜作木瓜使用的情况，影响木瓜的临床疗效。

木瓜和光皮木瓜含有三萜、有机酸、黄酮、多糖等成分[2-4]，但在具体成分及成分含量上差异较显著。刘世尧等[5]测定了木瓜和光皮木瓜总糖、可滴定酸、抗坏血酸、齐墩果酸、熊果酸、总黄酮、总皂苷等含量，多数指标为木瓜高于光皮木瓜，并采用模糊概率法进行综合评价，表明木瓜综合品质明显高于光皮木瓜。齐红等[6]利用HPLC转化波长法测定了木瓜属5种木瓜中齐墩果酸、熊果酸、绿原酸含量，显示木瓜含量较高，光皮木瓜含量较少。于晓亮等[7]对木瓜和光皮木瓜绿原酸、齐墩果酸、熊果酸和总黄酮进行了测定，表明在光皮木瓜中未检测到绿原酸，且齐墩果酸含量极低，总黄酮含量以木瓜较高，光皮木瓜较少。刘晓棠等[8]采用直接电位滴定法对总有机酸含量进行测定，表明皱皮木瓜中含量高于光皮木瓜。Du等[9]采用HPLC-DAD法和ESI-MS法对5种木瓜含有的黄酮类成分进行研究，表明表儿茶酸、原花青素在光皮木瓜和日本木瓜中含量较高，皱皮木瓜次之。受炮制时间、温度和辅料等影响，木瓜经炮制后所含部分成分含量会发生变化，如齐墩果酸、绿原酸、熊果酸、咖啡酸、没食子酸和皂苷[10]。

木瓜传统的药用评价是“味酸者为佳”，有机酸是木瓜镇痛、抗炎等作用的重要有效成分，包括脂溶性的三萜酸如齐墩果酸、熊果酸，中等极性的酚酸如绿原酸、咖啡酸等，水溶性有机酸如苹果酸、柠檬酸等[11-12]。2020年版《中国药典》一部以齐墩果酸和熊果酸的总含量控制木瓜的质量[1]，为了建立木瓜多指标质量控制的方法，本课题组在前期用HPLC法对木瓜及其酒制品中齐墩果酸、熊果酸和绿原酸含量测定的基础上[13-14]，采用梯度洗脱法建立木瓜HPLC指纹图谱，对木瓜、酒木瓜、光皮木瓜进行比较，为木瓜的鉴别和质量评价提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1200 Series高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Milli-Q SynthesisA10纯水仪(美国Millipore公司)；KQ5200B型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XS105型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 试剂与药物 10批木瓜饮片、2批光皮木瓜饮片经浙江省中医院陈建明主管药师鉴定为正品，具体信息见表1；酒木瓜饮片为自制。绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院)。乙腈、甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 参考文献[14]报道，Agilent SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-甲醇(B)-1%冰醋酸(C)，梯度洗脱，程序见表2；检测波长283 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成质量浓度为273.6 μg/mL的溶液，滤过，取续滤液，即得。

表1 木瓜信息

表2 梯度洗脱程序

2.3 供试品溶液制备 取不同批次木瓜饮片粉末各约1 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，精密称定质量，超声提取1 h，冷却至室温，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 吸取同一供试品溶液(S10)，按“2.1”项色谱条件下进样测定5次，以3号峰(绿原酸)为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD为0～0.18%，相对峰面积RSD为0～4.33%(除2号峰外其余均小于3%)，表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 吸取同一供试品溶液(S10)，于0、3、6、12、24 h按照“2.1”项色谱条件下进样测定5次，以3号峰(绿原酸)为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD为0～0.37%，相对峰面积RSD为0～2.93%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.3 重复性试验 称取同一批木瓜饮片粉末(S10)5份，各约1 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件下进样测定5次，以3号峰(绿原酸)为参照，测得各共有峰相对保留时间RSD为0～0.43%，相对峰面积RSD为0～4.60%，表明该方法重复性良好。

2.5 指纹图谱建立 称取10批木瓜饮片粉末约1 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对10批样品进行分析，见图1，共确定7个共有峰。与对照品比对后，可知3号峰为绿原酸，其含量较高、分离度较好，故选择其作为参照峰[编号3(s)]，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，结果见表3～4。由此可知，不同产地、批次样品主成分组成基本相同，但各成分含量存在差异，并且相似度均大于0.9。

图1 10批样品HPLC指纹图谱

表3 共有峰相对保留时间

表4 共有峰相对峰面积

2.6 木瓜、酒木瓜HPLC图谱比较 称取酒木瓜饮片粉末约1 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，见图2，它与木瓜的指纹峰数据见表5，并且相似度均大于0.9。由此可知，木瓜酒制前后共有峰数量一致，表明其成分种类无明显变化；但酒制品峰面积大于生品，与文献[13,15]报道一致。

表5 木瓜、酒木瓜指纹峰保留时间和峰面积

2.7 木瓜、光皮木瓜HPLC图谱比较 称取光皮木瓜饮片粉末约1 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，见图3，它与木瓜指纹峰数据见表6，并且相似度均为0.6。由此可知，光皮木瓜未检测到木瓜中原有的2号、3号(绿原酸)、4号峰，与文献[7]报道光皮木瓜中未检测到绿原酸一致。

图3 光皮木瓜HPLC色谱图

表6 木瓜、光皮木瓜指纹峰保留时间

3 讨论

3.1 色谱条件优化 本实验中考察了甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸和甲醇-乙腈-0.1%磷酸的分离效果，确定了乙腈-甲醇-1%冰醋酸的梯度洗脱条件，色谱峰数目多，基线平稳，分离度较好。结合木瓜所含的化学成分，比较了220、283、326 nm等不同波长下的图谱，结果在220 nm处干扰较大，在326 nm处出峰数目较少，在283 nm处图谱所反映的信息较多，分离度较好，故选择283 nm作为测定波长。

3.2 供试品溶液制备方法的优化 采用水、乙醇、甲醇、80%甲醇、60%甲醇等不同溶剂进行提取，结果以甲醇提取所得的色谱峰较多，峰面积较大，故选用甲醇为提取溶剂。对超声和回流提取方法进行比较，表明两种方法所得图谱基本相似，由于超声提取方便省时，故选择超声提取。对提取时间进行考察，结果提取1 h比45 min所得的峰面积较大，故确定超声提取1 h。

3.3 相似度结果分析 中药指纹图谱具有“整体性”与“模糊性”的特点，HPLC指纹图谱能较全面地反映所含成分的相对关系，能更好地鉴别中药品质及其炮制品，控制和评价药材的质量，为中药规范化炮制及其机制研究提供依据[16-17]。相似度是反映不同样品之间相关性的重要参数，实验结果显示同一品种的木瓜因所含成分基本一致，故相似度较高，但由于受产地、生长环境、采收季节等影响含量不同，色谱峰面积存在差异。木瓜酒制后色谱峰位置基本相同，共有峰数目无变化，色谱峰面积有差异，表明酒制对木瓜中化学成分的影响主要在于改变成分间的比例关系，而对成分种类无明显影响，故相似度较高。光皮木瓜和木瓜系两个不同的品种，成分差异较大，故相似度较低，该指纹图谱可用于两者的鉴别。

3.4 对木瓜酒制工艺及其机制研究的意义 酒制升提是中药炮制理论的重要组成部分，酒制有引药上行，缓解药性的作用[18]，酒制一方面使酒与药物协同发挥作用，增强活血通络作用，另一方面使药物有效成分易于煎出而增强疗效。酒制工艺条件如用酒量、炮制温度、时间等因素均会影响有效成分的溶出，导致质量不一，通过HPLC指纹图谱的相似性可用以反映木瓜酒制工艺是否稳定良好，从而保证饮片质量。实验结果表明木瓜酒制品的总峰面积大于生品的总峰面积，系因其所含的有机酸、萜类、黄酮等有效成分溶于乙醇，酒制后有利于成分溶出，从化学角度为酒制有利于疗效增强提供了依据。由于本实验所建立的指纹图谱仅能反映此色谱条件下的化学成分信息，酒制后其他成分含量及药效作用变化还有待深入研究。