薏苡仁麸炒前后治疗脾虚水湿不化谱效关系研究

孙贝贝， 孙海英， 朱伟豪， 洪 浩， 洪智慧， 杜伟锋,*， 葛卫红， 李昌煜

(1.浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 311402；2.浙江省台州医院，浙江 台州 317000；3.浙江中医药大学中药炮制技术研究中心，浙江 杭州 311401；4.浙江中医药大学中医药科学院，浙江 杭州 310053)

薏苡仁为禾本科植物薏苡Coixlacrma-jobiL. var.mayuen(Roman.)Stapf的干燥成熟种仁，甘、淡、凉，归脾、胃、肺经[1]。作为一种药食两用的常用中药，薏苡仁具有利水消肿、渗湿止泻、健脾、除痹、解毒散结之功效。现代药理研究表明，薏苡仁具有抗肿瘤、提高免疫力、抗炎、降血糖等药理作用[2-4]，常用于治疗肿瘤性疾病、免疫性疾病、关节炎、高血糖等病症[5-9]。薏苡仁中主要化学成分是脂肪酸及其酯类[10-11]、生物碱[12]、三萜类[12-13]、甾醇类、糖类化合物[14-15]。其中因薏苡仁中含有大量脂肪油，脂肪酸及其酯类成为薏苡仁中主要的化学成分。现代研究表明，油脂类成分在抗肿瘤方面发挥着关键的作用。目前药典标准规定只有甘油三油酸酯单一成分含量测定，且薏苡仁生品和麸炒薏苡仁的限度要求一致，难以体现出炮制特色。

中药指纹图谱能够较为全面的反映中药化学成分的种类和数量，能从整体上体现中药的内在质量。中药谱效关系的研究旨在将中药中复杂的化学成分与药效相结合，通过二者之间的关联度反映化学成分与药效数据之间的相关性，从而确定中药中不同化学成分对药效的贡献度大小，从而研究与药效相关的化学成分。

中药炮制作为中药的一大特色，具有增强药物疗效，降低毒副作用，纯净药材，改变药物的性能功效，便于储存，引药入经，最大限度发挥药材本身的功效。麸炒作为中药炮制方法的一种，可增强药物的健脾疗效，金传山等[16]通过小鼠抗疲劳实验及建立大黄脾虚小鼠模型，考察苍术不同炮制品对小鼠健脾作用的影响，得出麸炒品健脾作用明显，李爽等[17]通过研究薏苡仁及其麸炒品对动物胃肠动力的影响，发现薏苡仁麸炒品健脾作用强于生品，说明炮制后药效增强，但目前薏苡仁质量控制仅规定单一成分含量，针对其麸炒前后的多成分谱效关系研究，尚未见报道。本研究从麸炒前后薏苡仁指纹图谱与治疗脾虚水湿不化药效入手，采用灰色关联度法对谱效关系进行研究，旨在比较麸炒前后薏苡仁指纹图谱与药效的关联度，为后续研究其药效物质基础提供了依据。

1 材料

1.1 仪器 BIOBASE-EL10A博科酶标仪(济南鑫贝西生物技术有限公司)；华兴HX-T电子秤(杭州三里亭电子秤行)；NT-xs105电子分析天平(0.01 mg，瑞士Mettler-Toledo公司)；DFD-700电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；TG16-WS台式高速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；U3000高效液相色谱仪(美国Dionex公司)，配置四元梯度泵、在线真空脱气机自动进样器恒温柱箱、变色龙谱数据工作站；林恩3000蒸发光散射检测器；MIL-SYN型超纯水仪(美国Milipore公司)。

1.2 对照品 甘油三亚油酸酯(纯度99.8%，批号G601535)、甘油二亚油酸酯(纯度99.8%，批号D460610)、棕榈酸二亚油酸甘油酯(纯度99.8%，批号D460615)、亚油酸二油酸甘油酯(纯度99.8%，批号D482250)、棕榈酸二油酸甘油酯(纯度99.8%，批号D484205)、1,3-二棕榈酸-2-油酸甘油酯(纯度99.8%，批号D486845)购自加拿大多伦多研究化学公司；棕榈酸亚油酸甘油酯(纯度≥98%，批号SLBX4380)购自瑞典Larodan公司；甘油三油酸酯(纯度99.6%，批号111692-202007)购自中国食品药品检定研究院；1,3-二棕榈酸-2-亚油酸甘油酯(纯度99.8%，批号34-1618-7)购自德国西格玛奥德里奇公司。

1.3 试剂 大鼠胃泌素(GAS)酶联免疫检测试剂盒、大鼠胃动素(MTL)酶联免疫检测试剂盒、大鼠血管活性肠肽(VIP)酶联免疫检测试剂盒、大鼠生长抑素(SS)酶联免疫检测试剂盒。乙腈、二氯甲烷、异丙醇(美国Tedia公司)为色谱纯；水为超纯水。

1.4 药材 薏苡仁、麸炒薏苡仁饮片(生薏苡仁饮片5批，编号YXS-1～YXS-5；麸炒薏苡仁饮片5批，编号YXC-1～YXC-5)购自山东百味堂药业、四川康泉堂药业、安徽鹤年堂药业、遵义银花药业、安顺宝林科技及浙江中医药大学中药饮片有限公司等国内正规中药饮片企业，经浙江中医药大学葛卫红教授鉴定为正品。

1.5 动物 SPF级雄性SD大鼠60只，体质量(200±20)g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物使用许可证号SYXK(浙)2018-0012，温度20～25 ℃，相对湿度40%～60%，光亮/黑暗条件12 h/12 h。

2 方法

2.1 麸炒前后薏苡仁指纹图谱建立

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取甘油三亚油酸酯、甘油二亚油酸酯、棕榈酸二亚油酸甘油酯、亚油酸二油酸甘油酯、棕榈酸亚油酸甘油酯、1,3-二棕榈酸-2-亚油酸甘油酯、甘油三油酸酯、棕榈酸二油酸甘油酯、1,3-二棕榈酸-2-油酸甘油酯对照品适量，流动相[乙腈-二氯甲烷(65∶35)]制成质量浓度约为1.0 mg/mL的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液制备 取薏苡仁及麸炒薏苡仁粉末(过3号筛)各5批，每批约0.6 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入流动相50 mL，称定质量，浸泡2 h，超声处理(功率300 W、频率50 kHz)30 min，放冷，流动相补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 色谱条件 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈-二氯甲烷(65∶35)；柱温25 ℃；体积流量1.0 mL/min；蒸发光散射检测器，空气体积流量2.0 L/min；漂移管温度70 ℃，保留时间50 min，增益值2；进样量10 μL。

2.1.4 方法学考察 精密吸取供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定6次，每次10 μL，记录色谱峰相对保留时间及相对峰面积，计算其RSD，对重复性进行考察。

取薏苡仁粉末(过3号筛)，平行制备6份供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，记录色谱峰相对保留时间及相对峰面积，计算其RSD，对精密度进行考察。

取供试品溶液适量，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，记录色谱峰相对保留时间及相对峰面积，计算其RSD，对稳定性进行考察。

2.1.5 色谱峰指认 取对照品溶液适量，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，记录对照品色谱图，并与样品色谱图进行比对，指认色谱峰。

2.1.6 图谱生成 取供试品溶液，在“2.1.3”项色谱条件下进样测定，记录对照品色谱图，并将相关数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004版)，以样品S1的图谱为参照，时间窗宽度设定为0.1 min，采用中位数法，以参照峰进行峰匹配，并以生品、麸炒品各5批的指纹图谱共有模式为对照图谱R。

2.2 麸炒前后薏苡仁对脾虚水湿不化大鼠的药效学比较

2.2.1 分组 60只大鼠随机分为空白组、模型组，每组5只；生品给药组、麸炒品给药组，每组25只，分组后于新环境下适应性饲养7 d。

2.2.2 模型建立 除空白组外，其余各组大鼠每天饲以高脂低蛋白饲料，以10%体质量尾部负重，放入(20±2)℃、水深50 cm的圆筒中游泳到力竭为止，以鼻尖没入水中10 s为力竭标志，连续诱导6周，记录体质量变化。

2.2.3 给药 空白组、模型组大鼠灌胃给予10 mL/kg生理盐水，每天1次，连续2周。生品及麸炒品给药组按成人临床剂量换算大鼠等效剂量，以15 g/kg灌胃给药，每天1次，连续2周。末次给药前禁食不禁水24 h，称定大鼠体质量，3%戊巴比妥麻醉，腹主动脉取血，置于肝素钠抗凝管中静置1 h，离心(3 000 r/min)10 min后取上层血清，置于-80 ℃超低温冰箱中，采用ELISA法检测胃泌素(GAS)、胃动素(MTL)、血管活性肠肽(VIP)、生长抑素(SS)水平，同时称定胸腺、脾脏的质量。

2.3 灰色关联度分析

2.3.1 原始数据的无量纲化处理 采用均值法对原数据进行变换。变换的母序列记为{Ym(k)}，子序列记为{Yz(k)}。将生品、麸炒薏苡仁治疗脾虚水湿不化的药效指标作为母序列，生品、麸炒薏苡仁的共有峰峰面积作为子序列。

3 结果

3.1 指纹图谱

3.1.1 方法学考察 样品色谱峰峰面积RSD分别为1.03%～1.98%、0.51%～1.63%、0.32%～1.88%，保留时间RSD分别为0.06%～0.55%、0.02%～0.23%、0.03%～0.58%，均小于2.0%，说明该方法重复性、精密度、稳定性良好，可用于建立指纹图谱。

3.1.2 结果 经色谱峰匹配后，5批薏苡仁、麸炒薏苡仁的HPLC指纹图谱与其对照图谱之间的相似度分别为0.996～0.999、0.992～0.999，说明薏苡仁生品与麸炒品化学成分整体差异性不大，但共有成分存在差异，见图1、表1，符合谱效相关研究对样品的要求。另外，与图谱对比后发现，峰1～9为薏苡仁麸炒前后的共有峰，与相关对照品比对后，确认峰1为甘油三亚油酸酯，峰2为甘油二亚油酸酯，峰3为棕榈酸二亚油酸甘油酯，峰4为亚油酸二油酸甘油酯，峰5为棕榈酸亚油酸甘油酯，峰6为1,3-二棕榈酸-2-亚油酸甘油酯，峰7为甘油三油酸酯，峰8为棕榈酸二油酸甘油酯，峰9为1,3-二棕榈酸-2-油酸甘油酯。

图1 薏苡仁指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of Coicis Semen

表1 麸炒前后薏苡仁9种共有成分色谱峰峰面积

3.2 药效学

3.2.1 GAS、MTL、VIP、SS水平 如表2、图2所示，与空白组比较，模型组大鼠血清GAS、MTL水平均降低(P<0.01)，VIP、SS水平均升高(P<0.01)，证明大鼠胃肠功能基本紊乱，同时出现典型的纳呆、皮毛干枯、脱毛、倦卧懒动等症状，与脾虚水湿不化的临床表现基本一致；与模型组比较，生品给药组、麸炒品给药组大鼠血清VIP、SS水平降低(P<0.05,P<0.01)，GAS、MTL水平升高(P<0.05,P<0.01)，以后者更明显。

表2 炮制对大鼠血清GAS、MTL、VIP、SS水平的影响

注：与空白组比较，**P<0.01;与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与生品给药组比较,△P<0.05。图2 炮制对大鼠血清GAS、MTL、VIP、SS水平的影响Fig.2 Effects of bran stir-frying on the serum levels of GAS, MTL, VIP and SS in rats

3.2.2 炮制对大鼠体质量、胸腺指数、脾脏指数的影响 如表3、图3所示，与空白组比较，模型组大鼠体质量、胸腺指数、脾脏指数均降低(P<0.05)，表明模型建立成功；与模型组比较，生品给药组、麸炒品给药组大鼠体质量、胸腺指数、脾指数均有上升趋势，以后者更明显(P<0.05)。

表3 炮制对大鼠体质量、胸腺、脾脏指数的影响

注：与空白组比较，*P<0.05;与模型组比较，#P<0.05。图3 炮制对大鼠体质量、胸腺指数、脾指数的影响Fig.3 Effects of bran stir-frying on rat body mass, thymus and spleen indices

3.3 谱效关系 如表4所示，麸炒薏苡仁中9种共有成分与GAS、MTL、SS、体质量、胸腺指数、脾指数的关联度均明显高于生薏苡仁，而生薏苡仁中9种共有成分与VIP的关联度明显高于麸炒薏苡仁。

表4 麸炒前后薏苡仁9种共有成分对各药效指标的关联度

4 讨论

中药谱效关系的研究是指将中药中内在的化学成分与该中药相对应的药效指标进行结合，采用统计学的方法将二者进行关联分析，科学、系统的阐述中药内在化学成分与药效之间的关系[18]。

血浆胃泌素(GAS)能提高胃电慢波频率和加速胃窦收缩，舒张幽门泵，促进胃排空，对小肠、结肠的收缩也有一定的促进作用[19]。MTL由十二指肠及空肠黏膜单核细胞分泌，可直接作用于平滑肌细胞上的受体，引起平滑肌收缩和加快小肠蠕动，同时MTL还可以增强胃体收缩，加速胃排空液体，被认为是一种内源性激素促胃动素[20]。VIP是胃肠抑制性神经递质，延迟胃排空，抑制小肠环形括约肌的收缩，降低十二指肠收缩频率，松弛结肠平滑肌，减弱结肠运动[21]。SS是一种典型的脑肠肽，对胃排空、肠道内容物转运、回肠胆囊收缩等生物功能均有抑制作用[22]。根据研究结果发现，与空白组比较，模型组大鼠血清GAS、MTL水平均降低，VIP、SS水平均升高，证明大鼠胃肠功能基本紊乱，同时在实验中模型组大鼠出现典型的纳呆、皮毛干枯、脱毛、倦卧懒动等症状与脾虚水湿不化的临床表现基本一致。给药后，与模型组比较，生品给药组大鼠血清VIP及SS水平降低，GAS、MTL水平升高；麸炒品给药组大鼠血清VIP及SS水平降低，GAS、MTL水平升高。与生品给药组比较，麸炒品给药组大鼠血清MTL水平升高，GAS水平有所升高，VIP和SS水平有所降低，但无显著性差异。生品给药组与麸炒品给药组比较，后者对脾虚水湿不化的临床症状的治疗作用较优。说明薏苡仁炮制后对GAS、MTL、VIP及SS相关药效具有明显的提升。本研究为薏苡仁麸炒前后药效物质基础研究提供了理论依据。