基于婴幼儿奶嘴安全性的12种N-亚硝基胺及其迁移量测定方法研究——HPLC-MS/MS法

周雷，章宦胜，黄小凯

（国家鞋类质量监督检验中心(温州)，温州方圆检验认证有限公司，浙江 温州 325007）

前言

奶嘴是使用在奶瓶上帮助吸奶的一种工具，在原料上一般可以分为橡胶奶嘴，硅胶奶嘴等。奶嘴和安抚奶嘴以婴幼儿为主要消费群体，其质量高低会影响婴幼儿的身体健康。

N-亚硝基胺是一类具有-N-N=O 结构的有机化合物，期中90%左右的N-亚硝基胺可以诱发多种类动物不同器官的肿瘤，并且一次大量摄取和少量多次摄取均可诱发肿瘤[1]。1980 年，Preussmann 发现婴儿奶嘴、橡胶奶嘴含有挥发性的N-亚硝基胺，可迁移到唾液中。1982 年，Havery 和Fazio 发现使用传统消毒器对婴儿奶嘴和牛奶或婴儿药方消毒时，牛奶和药液中被混入N-亚硝基胺。美国环境保护署（Environment Protection Agency,EPA）污染物风险信息集成系统（Integrated Risk Information System,IRIS）将N-亚硝基胺的风险指数定为B2，即具有潜在人体致癌性[2]。

为有效消除橡胶制品婴儿奶嘴中可能存在的N-亚硝基胺对婴幼儿健康带来的危害，各国都出台了相应的政策及标准。1993 年，欧盟官方发布了93/11/EEC 指令，规定弹性体或橡胶奶嘴和安抚奶嘴中总N-亚硝基胺的迁移量不得高于0.01 mg/kg，总可亚硝化物质的迁移量不得高于0.1 mg/kg[3]。2015 年我国最新发布的国家标准《食品安全国家标准奶嘴》（GB 4806.2-2015）规定奶嘴中每种N-亚硝基胺不得超过0.01 mg/kg，每种N-亚硝基胺可生成物不得高于0.1 mg/kg[4]。

很长一段时间，对于痕量挥发性N-亚硝基胺的测定是一项困难而又耗时的工作。早期的检测手段有薄层层析法、紫外光谱鉴定法等。1975 年Fine 等人首先发明了对亚硝基结构具有检测特异性的热能分析仪[5]（TEA），从而成为检测N-亚硝基胺的专属仪器。

随着仪器的发展，质谱仪逐渐成为除热能分析仪之外使用最为广泛的检测仪器，越来越多的质谱仪（MS）用于N-亚硝基胺的检测。幸苑娜[6]先后采用气相色谱-正化学源质谱法和气相色谱-电子轰击源串联质谱法检测了橡胶制品中7 种N-亚硝基胺，检出限达到1.25 μg/kg，远低于93/11/EEC 的限量要求。目前，气相色谱-质谱联用（GC-MS），液相色谱-质谱联用（LC-MS）已成为应用最多的检测手段。

GC-MS 用于检测基质相对简单的挥发性N-亚硝基胺非常方便，但是该法前处理复杂，需将迁移液用有机溶剂萃取，而N-亚硝基胺性质不稳定，用有机溶剂进行洗脱及浓缩时易造成损失。同时对于一些难挥发、热不稳定的N-亚硝基胺，以及基质比较复杂的样品，该法容易出现假阳性，无法做到准确定性定量[7]。

LC-MS/MS 法是以质谱仪为检测手段，采用多反应监测模式，根据目标化合物的母离子及子离子信息，能够对目标化合物进行准确的定性定量，实现对奶嘴中低浓度的N-亚硝基胺进行检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器设备和试剂

Agilent1260（G1312B/G6495A）液相色谱-质谱联用仪；电热恒温水浴锅（上海新苗医疗器械制造有限公司）；纯水机，ZR0Q00800（MILLIPORE）；电子天平，赛多利斯BSA224S；pH计，赛多利斯PB-10。

12 种N-亚硝胺混标，200 mg/L，1mL，购自BePure 公司。使用时用甲醇配制合适浓度的工作曲线。

甲醇为液相色谱级/光谱级（坛墨质检科技股份有限公司）；甲酸，98%，为LC-MS 级（北京百灵威科技有限公司）。有机相针式滤器（13 mm，0.22 μm；上海安谱实验科技股份有限公司）；娃哈哈纯净水（娃哈哈集团有限公司）。

人工唾液：将4.2 g 碳酸氢钠，0.5 g 氯化钠，0.2 g 碳酸钾和30 mg 亚硝酸钠溶于水中并稀释至900 mL。调节pH 至9.0，必要时滴加盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节。转移至1L 容量瓶中，加水定容至刻度。

1.2 样品预处理方法

称取40 g 取自安抚奶嘴的奶嘴头，放入装有沸水的烧杯保持沸腾10 min，用镊子将奶头取出。冷却至室温，将每个奶嘴头纵向剖成两半，晾干。将样品剪碎至5 mm×5 mm，称取5 g 左右的样品，于适当容器中加入10 倍样品量预热至（40±2）℃的模拟唾液，确保样品完全浸没，置于（40±2）℃水浴中浸泡（60±3）min。将测试液过0.22 μm 微孔滤膜后，即可用于N-亚硝胺检测。

1.3 仪器条件

色谱柱：Eclipse Plus C18（3.0 mm×50 mm，1.8 μm）；流动相A：甲醇；流动相B：0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0.0～4.2 min，甲醇从30%线性增加到85%；4.2～6.0 min，甲醇从85%线性降低至30%；流速0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量5.0 μL。电离方式：ESI+；毛细管电压：4000 V；干燥气温度：250 ℃；干燥气流速：14 L/min；鞘气温度：350 ℃；雾化器压力：30 psi；喷嘴电压：500 V；监测模式：多反应监测（MRM）；MRM 参数见表1。

表1 12 种N-亚硝胺的MRM参数

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

在液质分析中，往流动相中加入缓冲盐，有助于提高目标化合物的离子化效率，流动相的组成对目标化合物的峰型及灵敏度有很大的影响。本方法采用甲醇-甲酸水溶液为流动相，相较于甲醇-乙酸铵水溶液、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-乙酸铵水溶液，甲醇-甲酸水溶液使得N-亚硝基胺具有较好的峰型和灵敏度。

2.2 质谱条件的选择

12 种N-亚硝胺类化合物在MRM 模式下均能得到良好的响应，在确定目标化合物的母离子和子离子后，将12 种N-亚硝胺混标稀释成1 μg/L 的工作液，在MRM 模式下，通过优化其他质谱参数，最终选择响应值最大、丰度最强、干扰最小的离子对。

2.3 标准曲线及线性范围

在优化的色谱和质谱条件下，将12 种N-亚硝胺物质分别配置成一系列不同浓度的标准溶液：1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL，进行检测，以信噪比S/N=3 计算检出限，其线性方程和相关系数见表2。12 种亚硝胺在1.0～20.0 ng/mL 之间线性关系良好，相关系数r2均不低于0.995。检出限为1 ng/mL。

表2 12 种亚硝胺线性方程及线性范围

2.4 回收率及精密度

按照1.2 方法对未检出亚硝胺的空白样品进行加标回收试验，添加水平分别为2.0、5.0、10.0 ng/mL，每个添加水平做7 次独立平行试验。试验所得回收率和精密度结果列于表3。12 种亚硝胺的回收率为90.0%～108.6%，相对标准偏差为0.62%～4.02%。

表3 12 种亚硝胺的回收率和相对标准偏差（n=7）

2.5 实际样品的的测定

应用本方法对市场销售的奶嘴随机抽取20 份进行检测。结果显示，所有婴幼儿奶嘴中均未检出亚硝胺物质。

3 结论

LC-MS/MS 法集高效液相色谱的高速、高分离能力与质谱高灵敏性和高选择性于一体；采用多反应监测模式，根据目标化合物的母离子及子离子信息，能够对目标化合物进行准确的定性定量，实现对奶嘴中低浓度的N-亚硝基胺进行检测。该法前处理简单，并且检测快速、高效，检出限低，抗干扰能力强，定性、定量准确，是一种能够快速的定性、定量检测奶嘴中N-亚硝基胺的分析方法。