香蒲雌花序中总黄酮的提取工艺研究*

宗春燕，苏学军，赵子龙

（泰州职业技术学院 药学院，江苏 泰州 225300）

蒲黄系香蒲属植物水烛香蒲、东方香蒲或同属植物的干燥花粉[1]。香蒲属植物为多年生、水生或沼生类草本，雌雄同柱，作为重要的水生经济作物，其遍布十分广泛，在我国各省共有12 种[2]。香蒲的雌雄花序均呈棒状，着生于同一花序轴上，雄花序细小而雌花序粗大。香蒲可用于工矿废水治理，可作造纸原料，能提高土壤肥力，在许多领域均有应用。人们对于香蒲花粉（即蒲黄）的药用价值研究较早，最早可见于《神农本草经》[3]，被列为草木上品，具有活血化瘀，止血镇痛，改善微循环，防治冠心病和心肌梗塞，兴奋收缩子宫等多种药理作用[3,4]。关于蒲黄中总黄酮的提取工艺，已有部分学者进行过相关的研究[5-7]，报道中均以药店购买的蒲黄药材为原料进行提取试验，而该药材一般是用采集的雄花序加工而成，对于同柱的雌花序中总黄酮的提取研究目前鲜有报道[8]。因此，本实验以泰州地区天德湖公园河道旁成熟的雌花序为原料，采用醇提取法研究香蒲雌花序中总黄酮的提取工艺，以期为该香蒲属植物的进一步开发利用提供依据。

1 实验部分

1.1 材料、试剂及主要仪器

香蒲雌花序（自制 产自泰州）；芦丁（HPLC≥98% 上海源叶生物科技有限公司）；无水乙醇（AR 国药集团化学试剂有限公司）。

DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；HKG-1OOA 型高速粉碎机（姜堰市新康医疗器械有限公司）；YP402N 型电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；TG16G 型高速离心机（盐城市凯特实验仪器有限公司）；SHZ-DⅢ型循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；TU-1810 型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 香蒲雌花序中总黄酮的提取 新鲜采摘的水烛香蒲的雌花序自然晾晒，干后捋取雌花序的蒲绒。取适量置于50℃的烘箱中烘干到恒重，并以粉碎机稍加粉碎，过40 目筛。精密称取2.0g 香蒲粉末于150mL 圆底烧瓶中，按实验设计的料液比加入一定浓度的乙醇溶液，浸泡30min，然后在微沸状态下回流提取至设定的时间，再在转速4000r·min-1条件下，离心分离10min，回收上清液，待测。

1.2.2 标准曲线的绘制 芦丁标准品低温烘干后，准确称取13.2mg，加入70%乙醇，超声溶解后移入100mL 棕色容量瓶中，70%乙醇定容，摇匀，配得浓度为132μg·mL-1标准品溶液。精密移取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL 的标准品溶液，分别置于10mL 棕色容量瓶中，在各个容量瓶中依次加入5%的NaNO2溶液0.3mL，摇匀，静置6min，加入10%的Al（NO3）3溶液0.3mL，摇匀，静置6min，再加入20%的NaOH 溶液2.0mL，用30%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，室温放置10min 后在最大吸收波长505nm 处测定吸光度。以吸光度A 为纵坐标，浓度c为横坐标，经线性拟合得回归方程为A=0.0150c-0.0291，R2=0.9975。

1.2.3 总黄酮含量的测定 移取1mL 提取液置于10mL 容量瓶中，加入30%的乙醇至5mL，再按1.2.2中方法加入显色剂进行显色反应，测出吸光度值，根据回归方程计算出香蒲雌花序提取液中总黄酮含量，按下式计算提取率。

式中 c：上清液中总黄酮的浓度，μg·mL-1；v：乙醇溶液体积，mL；n：稀释倍数；m：香蒲雌花序粉末的质量，mg。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对提取率的影响 准确称取2.0g烘干的香蒲雌花序粉末，分别使用浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液浸泡30min，设定料液比为1∶40（g∶mL），在微沸状态下提取1h，结果见图1。

图1 乙醇浓度对提取率的影响Fig.1 Effects of ethanol concentration on extraction rate of corcin

由图1 可知，在10%～40%的乙醇浓度范围内，乙醇浓度越高，雌花序中总黄酮的提取率也越大，当乙醇浓度为40%时，提取率最大，此后再增加乙醇的浓度，提取率反而呈下降趋势。这可能是由于香蒲雌花序中的黄酮类成分与40%的乙醇溶液极性相似，提取时有较多的黄酮溶出，因此，适宜的乙醇浓度选用40%。

2.1.2 回流时间对提取率的影响 准确称取2.0g烘干的香蒲雌花序粉末，选用浓度为40%的乙醇浸泡30min，设定料液比为1∶40（g∶mL），在微沸状态下提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，结果见图2。

图2 回流时间对提取率的影响Fig.2 Effects of extraction time on extraction rate of corcin

由图2 可知，提取时间在0.5～1h 之间，香蒲雌花序中总黄酮的提取率在增大，当回流时间超过1h后，总黄酮的提取率开始下降，这说明适当增加回流时间，会使雌花序中的黄酮成分更多的溶出，但一直保持微沸提取，若时间过长，则会影响黄酮成分的稳定性，引发部分黄酮分解，因此，回流时间选择1h 较好。

2.1.3 料液比对提取率的影响 准确称取2.0g 烘干的香蒲雌花序花粉末，选用浓度为40%的乙醇浸泡30min，分别设定料液比为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g∶mL），在微沸状态下提取1h，结果见图3。

图3 料液比对提取率的影响Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of corcin

由图3 可见，使用不同的料液比得到的香蒲雌花序总黄酮的提取率相差明显。起初，随着乙醇溶液用量的增加，提取率不断增大，在料液比达到1∶50时，达到最大值。此后，再增加乙醇溶液用量，提取率反而降低。当料液比值较大时，样品粉末与乙醇溶液接触不够充分，影响提取。随着料液比值的减少，植物细胞内外黄酮的浓度差逐渐增大，黄酮的溶出逐步趋于饱和，但溶出的杂质也会同时增多，会造成黄酮的提取率降低[9]。故料液比选择1∶50 为宜。

2.2 正交实验设计与结果

综合单因素试验考察结果，以总黄酮提取得率为评价指标，选取乙醇浓度、料液比、回流时间3 个影响因素进行3 因素3 水平正交设计，结果见表1、2。

表1 因素水平表Tab.1 Factor and level table

由表2 中R 值分析可以看出，香蒲雌花序中总黄酮提取率大小影响顺序为：回流时间＞料液比＞乙醇浓度，最佳组合为A3B2C2，即最佳工艺条件为乙醇浓度50%、料液比1∶50（g∶mL），回流时间1h。

表2 正交设计实验结果与分析Tab.2 Orthogonal design and experiment results

采用优化后的组合进行3 次验证性实验，总黄酮的提取率分别为3.48%、3.45%、3.42%，平均提取率为3.45%。

3 结论

本实验以香蒲的雌花序为提取原料，采用水浴乙醇浸提法提取其中的总黄酮，并通过单因素试验法及正交实验法考察了乙醇浓度、料液比、回流时间对提取率的影响，得到的最优工艺条件为：乙醇浓度50%，液料比1∶50，回流时间1h，香蒲雌花序中总黄酮的提取率可达3.45%。本研究可为香蒲雌花序总黄酮的提取提供一定的参考依据。