针刺对肥胖大鼠脂肪组织M1型巨噬细胞及IL-6表达的影响研究

莫灿婷,唐 霁,谢汉兴,蒋琰瑜,刘凯琪,谢万著,唐红珍

(广西中医药大学，广西 南宁 530001)

肥胖是由于机体脂肪过度堆积引起的慢性代谢性炎症，又称肥胖慢性炎症[1]。白细胞介素-6(Interleukin- 6，IL-6)及M1型巨噬细胞与肥胖慢性炎症的发生密切相关，临床研究结果显示，肥胖患者血清IL-6等炎症因子明显升高，使高血压、动脉粥样硬化等疾病的发病风险较正常人偏高[2]。此外，在动物实验研究中发现，M1型巨噬细胞表面标志物iNOS可诱导胰岛素抵抗，并引发肥胖[3]。肥胖慢性炎症的发病分子机制十分复杂，目前尚未完全阐明。课题组前期研究发现针刺可有效降低肥胖大鼠体质量及血清IL-6含量[4]，本实验通过针刺对肥胖大鼠脂肪组织iNOS及IL-6表达的影响，探讨针刺改善肥胖慢性炎症状态的分子机制，为临床治疗肥胖提供理论依据。

1 材料

1.1 实验动物

雄性SPF级SD大鼠共30只，体质量(180±10)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，合格证号:SCXK(湘)2019-0004。

1.2 主要实验仪器及试剂

华佗牌φ0.20 mm×25 mm的一次性无菌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司，180322);TG16W型微量高速离心机( 湖南吉尔森科技发展有限公司);FluorChem E超灵敏全自动成像分析系统(德国，Leica Histocore公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(Biosharp公司，BL521A);HE染色试剂盒、山羊抗兔、Anti-iNOS及IL-6等蛋白抗体(索莱宝公司)。

2 方法

2.1 模型制备及分组

将30只SD雄性大鼠随机分为两组，正常组8只，造模组22只，分别予普通饲料、高脂饲料喂养，均不限量自由摄食饮水，以造模组大鼠体质量超出同期正常组大鼠平均体质量的20%为造模成功。随后遴选出16只体质量达标的肥胖大鼠，并随机分为模型组、针刺组，每组各8只。

2.2 各组干预方法

实验采用本课题组前期研发的固定器固定大鼠，正常组、模型组按照针刺组要求进行等时固定；针刺组《大鼠穴位图谱》予以“关元、中脘，双侧足三里、天枢、丰隆和阴陵泉”等穴位针刺，选穴定位根据《大鼠穴位图谱》[5]，采用华佗牌φ0.20 mm×25 mm的一次性无菌针灸针，行捻转补法1 min，隔10 min行针1次，留针30 min，1次/d，6 d为1个疗程，每个疗程间隔1 d，共4个疗程，每7 d测量1次体质量。

2.3 各组大鼠内脏脂肪湿重

麻醉处死大鼠后，迅速分离其肾周脂肪、肠周脂肪及附睾脂肪等内脏脂肪，用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重，计算其内脏脂肪湿重。

2.4 各组大鼠附睾脂肪组织的HE染色

剪取一部分附睾脂肪组织放入10%中性福尔马林固定12 h后，包埋成蜡块，切片，按照HE染色试剂盒说明书进行染色，经梯度酒精脱水，二甲苯透明，用中性树胶封片，晾干，在显微镜下放大40倍后拍照，并计算完整脂肪细胞的面积。

2.5 附睾脂肪组织iNOS及IL-6的Western Blot检测

取每只大鼠附睾脂肪组织样本20 mg，加入组织裂解液后匀浆，离心后取上清，按BCA蛋白浓度测定试剂盒步骤，检测蛋白浓度，以 GAPDH 为内参，采用SDS-PAGE电泳，湿转法转膜，分别孵育I抗(iNOS、IL-6的稀释比例分别为1∶2 000、1∶4 000)，Ⅱ抗(1∶20 000)。用ECL化学发光试剂盒发光显影，Fluor Chem E全自动成像分析系统分析条带，计算灰度值。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 针刺治疗对肥胖大鼠体质量及内脏脂肪湿重的影响

针刺治疗后，与正常组比较，模型组大鼠体质量及内脏脂肪湿重显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，针刺组大鼠体质量及内脏脂肪湿重显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1～2。

表1 各组大鼠治疗后的平均体质量

表2 各组大鼠内脏脂肪湿重

3.2 针刺对肥胖大鼠脂肪细胞的影响

各组大鼠附睾周围脂肪组织HE染色结果显示，与正常组比较，模型组大鼠的脂肪细胞平均面积明显增大，差异具有统计学意义(P<0.01)，血管、纤维等结缔组织增多，与模型组比较，针刺组脂肪细胞平均面积显著减小，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表3、图1。

表3 各组大鼠附睾脂肪细胞平均面积

3.3 针刺对肥胖大鼠附睾脂肪组织中iNOS及IL-6蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠附睾脂肪组织中iNOS及IL-6蛋白的表达均显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，与模型组比较，针刺组大鼠附睾脂肪组织中iNOS及IL-6蛋白的表达均显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4、图2。

表4 各组大鼠附睾脂肪组织iNOS/GAPDH、IL-6/GAPDH的比值

4 讨论

脂肪组织，由成熟脂肪细胞、非脂肪细胞、结缔组织基质、血管及神经细胞组成，是人体能量平衡的重要调节器，具有分泌IL-6等多种促炎性因子及抗炎性因子的功能[6]。现有研究表明，炎性因子大量分泌、巨噬细胞浸润和脂肪组织重塑等是肥胖慢性炎症的几大主要特征[7-8]。脂肪组织长期的炎症状态，会使脂肪组织的血管、纤维等结缔组织适应性增多，导致脂肪组织重塑甚至纤维化，损坏脂肪组织的正常生理功能，进一步加剧肥胖的发生，并形成恶性循环的局面[9]。巨噬细胞主要分M1型及M2型，其中，Ml型巨噬细胞可分泌促炎性细胞因子IL-6[10]，并参与诱导肥胖慢性炎症的发生。此外，有研究表明慢性炎症参与机体胰岛素抵抗的发生。孔祥等[11]发现脂肪组织的炎症会促进细胞的凋亡，大量招募单核巨噬细胞，吞噬坏死的蛋白质及细胞器，形成“冠状结构”(Crown-likestructures,CLS)，在这一过程中M1型巨噬细胞的表达显著增加，又进一步促进IL-6的分泌，并抑制胰岛素信号传导，导致机体的糖脂代谢障碍。王翠娟等[12]发现腹型肥胖患者的IL-6水平升高导致胰岛素稳态失衡，使机体处于糖脂代谢紊乱的状态。郜敏等[13]体外实验研究发现高糖条件可诱导MI型巨噬细胞标志物iNOS的表达升高，予胰岛素作用后又可下调其表达水平，这一结果提示M1型巨噬细胞可能是促进胰岛素抵抗的重要危险因子。本实验研究结果显示，肥胖大鼠脂肪细胞增大、血管和纤维等结缔组织增多，iNOS及IL-6的蛋白表达升高，可见其脂肪组织存在慢性炎症，经针刺治疗后，能显著减少脂肪细胞堆积、下调iNOS及IL-6的蛋白表达，有效降低肥胖机体内脏脂肪湿重及体质量，这一结果与张思依等[14]的研究结果相似。此外，课题组前期的实验结果显示针刺能显著降低肥胖大鼠血清胰岛素及IL-6等炎症因子的水平[4,15]。因此综上述研究结果可初步证实，针刺能有效降低肥胖大鼠的体质量，改善脂肪组织血管、纤维等结缔组织增生及脂肪细胞增大的现象，其机制可能与针刺下调脂肪组织中M1型巨噬细胞及IL-6的蛋白表达、抑制脂肪组织慢性炎症和改善胰岛素抵抗以促进机体糖脂的正常代谢有关。

中医认为“肥人多痰湿”，机体的水液代谢障碍是导致痰湿形成的主要原因，本实验研究针刺组方中，关元有下丹田之称，既是足三阴经及任脉之会，也是小肠之募，可培补元气，增强小肠分清泌浊的功能，足三里、阴陵泉是脾胃之合穴及下合穴，可增强脾胃的运化功能，合络穴丰隆则更显祛湿化痰之功；天枢为大肠之募，可增强大肠主津传化糟粕的功能。以上诸穴合用，既可固本培元，又可健脾和胃，促进机体水液的正常代谢，可有效地防止痰湿积聚而导致肥胖。本研究发现，针刺能有效调节M1型巨噬细胞、IL-6的过度表达，改善肥胖机体的慢性炎症，恢复机体的正常代谢功能，减少脂质积累，以达到治疗肥胖的目的。 结合前文的研究结果提示，从控制肥胖慢性炎症的新视角改善胰岛素抵抗，可为临床治疗肥胖症提供新靶点。但关于针刺如何通过调节M1型巨噬细胞及IL-6的表达以抑制肥胖机体的慢性炎症，改善胰岛素抵抗的信号分子机制尚未明确，仍需在今后进一步深入研究。