差示扫描量热(DSC)图谱匹配识别法在鱼腥草产地快速鉴别中的应用

邹 涛 陈宇迪 莫单丹 赵 瑾 和莉颖 郭 姝 欧春丽 曾智强 缪剑华*

(1.北京市理化分析测试中心，北京 100089；2. 广西药用植物园，广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，南宁 530023；3. 耐驰科学仪器商贸(上海)有限公司，上海 200131)

鱼腥草属三白草科蕺菜，是多年生草本植物蕺菜的带根全草，性寒味辛，入肺、肝经，具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋、止血镇痛、祛淤生新、增强免疫等功能[1，2]。在北方一些地区鱼腥草主要作为中药使用，在长江以南地区鱼腥草还可作为野生蔬菜。鱼腥草已经被国家卫生部正式确定为“既是药品，又是食品”的极具开发潜力的植物资源之一[3]。鱼腥草广泛种植于我国南方各省，但由于各地日照、土壤等条件的差异，已有大量研究表明不同产地鱼腥草的药效品质存在明显的不同[4-9]。长期以来，不同产地中药材成分和药性的差异严重制约了中医和中药材的发展，一般只有道地性药材才能发挥出最好的药效。目前，中药材的鉴别方法主要有色谱法、光谱法、分子生物学技术、指纹图谱鉴定技术等[10-14]。通常的鉴别方法均以样本中某些有效成分为目标物，比如测定鱼腥草中的总黄酮、槲皮苷等物质，通过测量这些物质的含量进行鉴别[15，16]。然而这些方法往往预处理繁琐，效率低，而且使用大量有机试剂，成本高，环保隐患大。更重要的是，鱼腥草某些成分的含量可以作为品质检验的指标，但并不足以成为产地鉴别的充分必要条件,因此中药材的道地性鉴别研究是目前的一个难点。

差示扫描量热法(DSC)是一种常见的热分析方法，具有操作简单，不用溶剂，样品用量少，具有检测快速和图谱简单易懂的特点。然而多年来DSC方法并没有被真正应用于中药材产地鉴别，只能通过DSC曲线的特征峰温度的位置和形状定性判断中药材的真伪，且只能对不同物种进行区分鉴别。究其原因主要有两点：(1)对于天然植物样品，常规的DSC测量方法并不能得到有辨识度、稳定重复的谱图；(2)通常的DSC谱图解析往往着眼于谱峰归属，热焓计算等，而中草药(例如鱼腥草)的DSC曲线，由于其成分复杂，其各个热效应峰为多组分的综合热效应，很难归属到具体的物质，常规谱图分析方法并不适用，甚至还不如成分测量简单直观。本研究则从这两个方面入手，首先优化了DSC测量方法，采用耐高压不锈钢坩埚有效抑制组分挥发对测量谱图的干扰，探讨了其它主要的测量参数影响，最终得到稳定、辨识度高的鱼腥草DSC图谱，通过对不同产地鱼腥草样本的重复测试，考察了实验方法的重复性和稳定性。随之，本文考察了16个不同产地的鱼腥草样本，建立鱼腥草产地DSC图谱数据库，通过图谱匹配识别算法，达到快速有效鉴别鱼腥草产地的目的。

1 材料与仪器

1.1 鱼腥草样本

由广西壮族自治区药用植物园提供从不同种植地区采集的鱼腥草整株样本(16种)，随机编号为1#～16#。上述样品经广西壮族自治区药用植物园缪剑华研究员鉴定。

1.2 样本预处理

样本经过60℃恒温24小时烘干，粉碎处理(多功能粉碎机)，采用电动振筛机(8411型)筛分成4个颗粒度的样本(>60目、60目～110目、110目～170目、<170目)用于测试。

1.3 DSC仪器

实验采用DSC 204 F1差示扫描量热仪；常压密闭铝坩埚(耐压3MPa)和密闭不锈钢坩埚(耐压10MPa)；Proteus数据处理软件。

2 结果与讨论

2.1 DSC测试方法优化

2.1.1坩埚类型的优化

鱼腥草样品含有多种挥发物质，例如水分、芳香物质等，这些物质的挥发过程是吸热的。这些吸热效应会对其它反应(例如某些成分的氧化等)产生干扰甚至掩盖，常规的DSC测量方法(铝坩埚加盖，盖上扎孔)下，各种热效应重叠后就使得谱图整体上失去了辨识度，而且会导致数据不稳定。因此我们的首要工作是抑制实验过程中的挥发现象。本研究采用密闭坩埚实现这个目标。

任取一个鱼腥草样本(5#，约20mg，颗粒度为<170目)，分别使用常压密闭铝坩埚和耐高压密闭不锈钢坩埚进行DSC测试。温度程序：以5℃/min的升温速率从60℃升温至350℃。实验结束后取出坩埚发现常压密闭铝坩埚都存在鼓包爆开漏气现象具体结果见图1。图1A为常压密封铝坩埚3次平行测试的结果，从图中可以看出：在150℃～240℃间有一个宽的放热峰，在250℃～265℃间有一个尖锐的吸热峰。无论从峰的位置还是峰的面积，这3次测试结果重现性差，而且随着温度升高，鱼腥草易挥发成分的释放导致坩埚内压力增大致使坩埚鼓胀爆开。为解决这个问题，本研究采用耐高压的不锈钢坩埚进行测试，结果如图1B所示，从图中可以看出：3次平行测试的DSC曲线拓扑图形基本一致，峰位置与热焓值也基本相同。可见使用耐高压坩埚抑制挥发反应有效，测试重复性好，合理可行。

图1 常压密闭铝坩埚3次平行测试

2.1.2升温速率的优化

分别称取编号为5#，目数<170目的鱼腥草样本约20mg，装入4只不锈钢坩埚内，分别以2℃/min、5℃/min、10℃/min和20℃/min升温速率从60℃升温至350℃，考察不同升温速率对DSC结果的影响，结果如图2所示。

图2 鱼腥草不同升温速率的DSC曲线图

结果显示，随着升温速率的提升，两个放热峰的位置均向高温段移动，这是由于升温速率变快导致的滞后现象，升温速率越快这种滞后现象就越加明显。同时随着升温速率的加快，峰拖尾和重合叠加的效应越明显，会导致DSC图谱失去很多信息。另外一方面，升温速率过低时，灵敏度降低，DSC峰不明显，测试耗时长。因此，综合考虑效率和谱图信息的情况下，实验选择5℃/min的升温速率。

2.1.3样本颗粒度的优化

同样以5#鱼腥草样本为例，称取颗粒度分别为<170目、110目～170目、60目～110目之间和>60目的样品20mg，以5℃/min升温速率升温至350℃，考察不同颗粒度对DSC结果的影响，结果如图3所示。

图3 不同颗粒度的5#鱼腥草样本的DSC曲线图

从图中可以看出，随着颗粒度变大，两个放热峰的位置均出现了滞后的情况，第1个放热峰更加明显一点，<170目的样本第一个放热峰峰值温度为142.7℃，>60目的为151.5℃，滞后约9℃，这可能是由于颗粒越大越不利于传热与反应。同时组成第2个大峰的3个峰的比例出现变化，205℃左右的第1个肩峰比例降低到最后几乎看不出来，而275℃左右的第3个肩峰逐渐变得明显。为保留更多的峰信息，而且较细的颗粒度使在测试取样量较小的情况下更具样本代表性，因此本实验最后确定<170目的样本，称样量约为20mg，以5℃/min升温速率升温至350℃来考察鱼腥草样本的DSC曲线。

2.2 DSC测量方法的验证

按上述方法对16个鱼腥草样本进行重复性测试，每个样品取4平行。仍以5#鱼腥草的DSC曲线为例，对得到的DSC曲线的两个放热峰的起始点温度、峰值温度及峰面积进行了标注，具体结果见表1。

表1 鱼腥草5#平行实验间的DSC曲线特征值及重复性列表

从表1的数据可以看到：第1个放热峰的峰值温度在142.8℃左右，焓值约为25.8 J/g。第2个放热峰的峰值温度在226.4℃左右，焓值约为155.4J/g，所有特征温度的数据的标准偏差均小于0.5%，说明此方法重复性良好。

按2.1方法对16个样品分别进行测试，其DSC曲线如图4所示。从图上可以明显看出不同产地鱼腥草的DSC曲线及其特征峰都有差异，有的差异明显，有的差异较小，这些差异反映了不同产地鱼腥草在化学成分和理化性质上存在差异，而本研究改进的DSC测量方法能够清晰地展示这些差异，说明此方法特异性良好。

图4 16个鱼腥草样本的DSC曲线

由于样品的“微环境”(密闭坩埚内)是空气气氛，这些放热峰对应于组分的氧化和热裂解。虽然放热反应的详细机理尚待进一步研究，但是上述的实验方法与参数，可以得到稳定可靠的鱼腥草DSC谱图。

2.3 鱼腥草DSC谱图相似度计算与识别

2.3.1鱼腥草DSC谱图相似度计算

优化的DSC测量方法为本研究对鱼腥草DSC图谱进行“宏观”比对建立了基础。所谓宏观比对，指的是不再采用常规的DSC解析方法，不以具体峰值和峰面积为参数，而是计算两条DSC曲线的相似度，通过相似度匹配达到产地鉴别的目标。这个方法类似于人脸识别技术。

对于本实验研究的鱼腥草DSC图形识别方法的原理和流程如下：(1)通过DSC测试得到DSC曲线图像；(2)对测得的DSC曲线图像二值化处理；通常可以将DSC曲线定义为一个像素点的集合，对于一幅大小为m×n的谱图图像s,可将其定义为点集：

s={pi,j}i=1,2,…,m;j=1,2,…,n

(1)

根据式(1)，点集s满足下述条件：i的取值范围为整数1～m，j的取值范围为整数1～n，且i，j的取值涵盖了其各自取值范围内的所有可能组合；同时像素点pi,j在曲线中对应的位置为(x,y),x的取值范围为温度范围60℃～350℃，y的取值范围为热流信号强度范围；(3)获取图像识别所需的特征点，如峰起始温度点，峰值温度点，焓值面积等特征信息，将所得的信息保存成数据库；(4)对新测试的DSC曲线与数据库中的曲线逐一匹配，计算相似度，输出识别结果。

依然以5#样本为例，如表2所示，研究发现平行测试曲线之间的相似度均超过99%，这说明该方法是合理的。其余样品通过类似处理，同一产地鱼腥草样品平行测试的DSC曲线间的相似度也均超过99%，说明该方法重复性好可靠性高。

表2 鱼腥草5#平行实验间的DSC曲线特征值及图形识别相似度列表

2.3.2鱼腥草DSC谱图相似度识别

如上所述，可以事先采集不同产地鱼腥草样本建立DSC曲线数据库，对未知样品的DSC曲线进行相似度匹配，从而实现不同产地鱼腥草的快速分类鉴别。本研究将16种鱼腥草样本的DSC图谱建立数据库，然后在这16种样本中分别重新取样，按照2.1方法测试，将测得的DSC谱图与数据库进行逐一匹配识别，最终的识别验证结果如表3所示。

表3 16个鱼腥草样本的相似度识别列表

表3数据结合图4可见，对于DSC图谱比较接近的样本，本研究算法可以得到较高的相似度，反之则计算得到较低的相似度。而且对于本类样本，相似度数值均达到99%以上,识别准确率达到100%，说明本研究采用的相似度算法稳定可靠。

3 结论

本研究首次将DSC图谱相似度识别匹配技术应用到鱼腥草产地的鉴别研究中，结果表明该方法识别度好，准确率高，操作简单方便，能够实现鱼腥草样品产地的高效、准确鉴别，为DSC法用于中药材产地鉴别提供了定量化基础，也为鱼腥草及其他中药材的道地性鉴别研究和质量控制提供了新的研究方法和思路。此外，中药材的药效一般与药材的土壤、环境、气候水文条件等息息相关，通过不同产地鱼腥草的药性、环境条件与DSC图谱特征的相关性研究，也可能为道地性药材基地的选址建立提供科学的参考依据，这也将是我们需要深入研究的一个方向。