动物园梅花鹿源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及耐药性

王炜强 孙浩云 杨志松*

(1.西华师范大学生命科学学院，南充，637000；2.山东新华医疗器械股份有限公司，淄博，255000)

梅花鹿(Cervusnippon)是鹿科(Cervidae)鹿属动物，具有14个亚种，是亚洲东部的特产种类之一，也分布于俄罗斯东部、日本和朝鲜，曾广布中国各地，现仅残存于吉林、内蒙古中部、安徽南部、江西北部、浙江西部、四川、广西等几个有限的区域内，因其夏毛棕黄色、遍布鲜明的白色梅花斑点，故称“梅花鹿”[1-4]。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)属于条件致病菌，该菌主要包括3个亚种，主要存在于动物及人的消化道、呼吸道、泌尿生殖道等，可引起禽类、哺乳动物、鱼类等多种动物发病，为临床中重要的人畜共患病之一[5-7]。近年来，关于野生动物感染肺炎克雷伯氏菌的报道逐渐增多，已从多种患病的动物体内分离得到高致病性、高耐药性肺炎克雷伯氏菌[8-9]。肺炎克雷伯氏菌主要引起梅花鹿的败血性肺炎，2009年首次被报道。梅花鹿感染肺炎克雷伯氏菌后主要表现为咳嗽、呼吸困难、逐渐消瘦，严重的可引起死亡，剖检可见肺脏淤血、出血、水肿等，肝脏表面有小白色的坏死点[10-11]。肺炎克雷伯氏菌的治疗临床中主要以抗生素防治为主，由于不合理使用导致多重耐药菌株不断出现，不仅为养殖业造成严重的经济损失，同时威胁公共卫生安全[12]。本研究采集动物园患有呼吸困难的及死亡梅花鹿的咽拭子、肺脏、心血、肝脏等病料组织76份，进行肺炎克雷伯氏菌分离鉴定，对其致病性和耐药性检测，旨在为梅花鹿源肺炎克雷伯氏菌防控及临床合理用药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

2018—2020年，从南充西山动物园采集患有呼吸困难的及死亡梅花鹿的咽拭子、肺脏、心血、肝脏等病料组织76份。

1.1.2 主要试剂

普通营养肉汤、普通营养琼脂平板、肺炎克雷伯氏菌鉴别培养基——麦康凯肌醇阿东醇羧苄青霉素琼脂(MIAC)，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；Raid ID 32 E阴性菌鉴定试条购自bio-Merieuxsa公司；药敏纸片购自广东环凯生物有限公司；DL2000 marker，2×TaqMarker Mix，均购北京索莱宝科技有限公司。

1.1.3 试验动物

25 g左右昆明系小鼠，由华中农业大学动物医学院动物实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养

将采集的患有呼吸困难的及死亡梅花鹿的咽拭子、肺脏、心血、肝脏等病料组织处理后，直接接种于MIAC平板，37 ℃培养12～18 h，挑MIAC平板的单个菌落接种于营养肉汤中进行纯化培养后，进行形态学观察和生化试验鉴定。

1.2.2 生化试验

将分离菌株纯化培养的菌液浓度调整为0.5个麦氏浊度，按照Raid ID 32 E肠杆科阴性菌鉴定试条说明书对分离菌株进行生化鉴定。

1.2.3 细菌的PCR鉴定

按照韩坤[6]的方法，设计肺炎克雷伯氏菌保守区16S rRNA引物：P1，5′-ATGAAACGACCTGATTGCATTCGC-3′；P2，5′-TTACTTTTTCCGCGGCTTACCGTC-3′。该引物由华大基因合成。用水煮法提取分离菌株的DNA，用16S rRNA引物对疑似肺炎克雷伯氏菌的分离菌株进行PCR检测，PCR产物送上海生工进行基因测序，其测序结果采用 NCBI-BLAST比对，同源性≥99.0%，可以定义到种的水平；若同源性在97.0%～98.9%，可以定义到属的水平；若同源性<97.0%，则定义为科水平，鉴定标准按照同源性≥97.0%判定。

1.2.4 致病试验

按照张文举等[13]的方法，对培养至对数期的分离菌株进行计数，每株分离菌株采取腹腔注射方式注射5只小白鼠，剂量为0.25 mL(108cfu/mL)，对照组注射等量无菌的生理盐水，攻毒12 h后，试验期为6 d，试验期间观察小白鼠发病情况，并进行细菌分离鉴定。

1.2.5 药敏试验

参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)2019推荐的标准K-B纸片法进行试验，以及结果判断、统计结果并分析分离菌株的耐药性。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养

疑似肺炎克雷伯氏菌分离菌株在鉴别培养基MIAC上长出了边缘整齐、大小一致、半透明的桃红色菌落。革兰染色镜检观察到，分离菌株为阴性的两端钝圆的粗短杆菌状，与《伯杰氏细菌鉴定手册》报道的肺炎克雷伯氏菌的培养特性与形态学基本一致。

2.2 细菌生化鉴定

由表1可见，梅花鹿源肺炎分离菌株初步被鉴定为肺炎克雷伯氏菌，符合率在95%以上。

表1 梅花鹿源肺炎分离菌株的生化检测结果

2.3 细菌的PCR鉴定

对初步鉴定为肺炎克雷伯氏菌的52株分离菌株，用16S rRNA引物进行PCR鉴定。结果显示，52株肺炎克雷伯菌分离株均扩增出大约为1 500 bp的目的条带(图1)。测序结果显示，从患病梅花鹿体内分离的52株肺炎克雷伯氏菌与GenBank中登录的12株肺炎克雷伯氏菌参考菌株的同源性为97.0%～99.0%，从而在分子生物学水平证实了从患病梅花鹿体内分离的菌株为肺炎克雷伯氏菌。

图1 分离菌株PCR鉴定结果

2.4 致病性检测

试验组攻毒的小白鼠在攻毒后2～6 d出现不同程度的发病症状，主要表现为采食量减少、精神沉郁、呼吸困难、慢慢出现死亡，个别的小鼠出现急性死亡。剖检死亡的小白鼠，采集肺部、肝脏中分离得到的肺炎克雷伯菌，对照组的小鼠健康存活。经统计，40株肺炎克雷伯氏菌对小白鼠具有不同程度的致病性。

2.5 耐药性分析

用K-B药敏纸片法检测致病性肺炎克雷伯氏菌耐药性，由其耐药性(表2)可知，40株致病性肺炎克雷伯氏菌对阿莫西林、氨苄西林、恩诺沙星、庆大霉素、新霉素、多西环素、大观霉素、林可霉素、磺胺二甲氧嘧啶9种药物耐药性较高，耐药率在70.0%～100.0%，对头孢噻呋、头孢喹肟、环丙沙星、氧氟沙星、氟苯尼考5种药物耐药率较低，耐药率在7.5%～27.5%。这表明，分离的40株致病性肺炎克雷伯菌对临床中常用抗生素产生了不同的耐药性。

表2 分离菌株的耐药性结果

3 讨论

肺炎克雷伯氏菌可以引起多种动物和人发病，该菌主要存在不同宿主的呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，并引起感染，该菌也是人外科手术中常见的耐药性菌之一，对人的危害也很大，是临床中重要的人畜共患病之一[7-8]。在正常情况下，肺炎克雷伯氏菌不会引起动物发病，但当外界环境条件改变，出现冷热交替、换料及运输等因素导致其机体抵抗力低下时，该菌在宿主的体内大量繁殖并致病，发生内源性感染，其感染率和病死率均较高[14-15]。

相关研究表明，水貂(Neovisonvison)、狐狸(Vulpexlagopus)、梅花鹿等多种动物感染肺炎克雷伯菌后，主要临床表现为咳嗽、呼吸困难，急性感染可以造成鼻孔、嘴角出血，严重可以导致其死亡，同时还可以继发大肠杆菌(Escherichiacoli)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)或巴氏杆菌(Pasteurella)等多种病原感染，呈现混合感染的状态，对动物的危害较大，尤其对水貂、狐狸、貉(Nyctereutesprocyonoides)等动物养殖造成严重的经济损失[6-11]。本试验从76份采集自动物园患有呼吸困难的及死亡梅花鹿的咽拭子、肺脏、心血、肝脏等病料组织中分离得到了40株致病性肺炎克雷伯菌，证明该菌是引起梅花鹿肺炎的主要病原菌，其可能存在潜在威胁，应该引起重视，并注意做好防控。

肺炎克雷伯氏菌对临床中常用的抗生素药物产生很强的耐药性，个别的分离菌株对β-内酰胺类及碳青霉烯类抗生素也产生耐药性，给治疗带来了很大的困难，应该引起重视[12-15]。国内对狐狸、水貂、猪、牛等动物源肺炎克雷伯氏菌的耐药性报道比较多，关于梅花鹿源肺炎克雷伯氏菌的耐药性报道较少。本研究表明，分离的40株致病性肺炎克雷伯菌对阿莫西林、氨苄西林、庆大霉素等9种药物耐药率在70.0%以上，对其他药物的耐药率在7.5%～27.5%。说明从动物园梅花鹿体内分离的肺炎克雷伯氏菌耐药性严重。当发生本病时，应该合理用药，提高治疗效果。由于该菌是通过呼吸道进入肺部，引起肺部实变和肺炎，在防治过程中应进行环境消毒，综合防控，减少该病的发生与流行。