石首麋鹿产气荚膜梭菌病的综合诊断

付宇航 汪明权 高 兴 李可伟 杨 涛 张玉铭 李家奎*

(1.华中农业大学动物医院，武汉，430070；2.武汉动物园，武汉，430051；3.石首麋鹿国家级自然保护区，石首，434400)

麋鹿(Elaphurusdavidianus)是我国特有的珍稀濒危鹿科(Cervidae)动物，也是国家一级重点保护野生动物[1]，被世界自然保护联盟(IUCN)列为野外灭绝(EW)[2]。2021年1月18—24日，湖北省石首麋鹿国家级自然保护区多头麋鹿死亡，采集病死鹿组织和粪便样品后送检至华中农业大学动物医院，通过麋鹿发病时的临床症状、病理剖检；细菌分离培养、革兰氏染色镜检，病理组织切片观察；细菌16S rDNA PCR扩增及测序比对、多重PCR鉴定及生化鉴定，确诊病死麋鹿为产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)感染。

1 临床症状

发病麋鹿精神沉郁，步态缓慢，离群索居，食欲减退，喜饮水，肛门周围污秽不堪，排酱油色稀便，内混有脱落肠黏膜碎片(图1)，继而死亡。该病病程短，病死率高，鹿死后腹部迅速膨大，眼结膜充血，鼻孔流出带血泡沫样鼻液，发病鹿或死亡鹿大多为膘情好、体格健壮的成年鹿，雌鹿多于雄鹿。

图1 发病麋鹿酱油色稀便

2 病理剖检

剖检发现：肝脏肿大边缘钝圆，呈淡粉色，质脆，表面有出血斑或出血点(图2A、B)。脾脏肿大，表面遍布出血斑，边缘有坏死区(图2C)。肾脏肿大呈土黄色，质地柔软易碎(图2D)。心脏内血液凝固不良，呈暗褐色(图2E)。肠道黏膜可见出血性溃疡或弥漫性出血性坏死，尤以空肠、回肠、盲肠最为严重，肠道膨大，呈灰绿色，内充满恶臭气体(图2F)。肺脏充血肿胀，肺泡腔内充满带血泡沫样液体。

图2 发病麋鹿剖检病理结果

3 实验室诊断

3.1 病理组织切片观察

空肠绒毛多坏死脱落，固有层、肌层有充血、浆液或纤维素渗出，固有层内有大量炎性细胞浸润(图3A)。肝细胞均表现不同程度的颗粒变性、空泡变性和脂肪变性，中央静脉内充满红细胞，肝窦内有红细胞和少量炎性细胞浸润(图3B)。肾小球毛细血管扩张充血，肾小球肿胀，内有大量炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞变性坏死，管腔狭窄，部分肾小管上皮细胞出现脂肪变性和空泡变性，肾小管管腔中可见大量粉红色浆液，肾间质严重出血并混有少量炎性细胞(图3C)。脾脏白髓和红髓均可见淋巴细胞坏死，淋巴细胞数量减少，红髓区结构疏松，结构不清晰，红细胞显著增多(图3D)。

图3 发病麋鹿组织病理切片

3.2 病料涂片染色镜检

无菌操作取肠道内容物涂片经革兰氏染色后，置于100×油镜下观察，可观察到镜下菌体呈革兰氏阳性，短杆状，两端钝圆，单个或成双排列(图4)。

图4 麋鹿肠道组织涂片革兰氏染色镜检

3.3 细菌分离培养与染色镜检

采用无菌操作方式，蘸取麋鹿肝、脾、肾、肠道内容物，3区划线接种于强化梭菌琼脂培养基，将接种后的平板置于43 ℃厌氧培养18～24 h，次日挑取单菌落传代纯化培养，观察纯化培养后的菌落形态并挑取单菌落进行革兰氏染色镜检。结果显示，菌落呈圆形，扁平，中央隆起，半透明，乳白色至淡黄色，边缘整齐，直径0.2～0.5 mm(图5A)；菌体呈革兰氏阳性、有荚膜的长杆状菌，菌体两端钝圆，单个散在或成对存在(图5B)。

图5 麋鹿内脏内容物细菌培养与染色镜检结果

3.4 细菌生化鉴定试验

将分离纯化的细菌在超净工作台中接种于葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、肌醇、七叶苷、甘露醇、鼠李糖、水杨苷、硫化氢、山梨醇、明胶生化发酵管和含铁牛乳培养基中，培养6～72 h。结果显示，该菌可以发酵葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖和肌醇，不发酵鼠李糖、甘露醇和山梨醇；硫化氢、明胶液化实验结果呈阳性，七叶苷、水杨苷实验结果呈阴性(表1)；在含铁牛乳培养基发酵实验中，该菌接种6 h后，发酵管中开始出现产气现象，后牛奶凝固，并产生大量气体使凝固的牛奶呈蜂窝状，并置于培养基上层，呈“暴烈发酵”现象(图6)。

表1 分离菌株的生化鉴定结果

图6 含铁牛乳培养基发酵结果

3.5 细菌16S rDNA鉴定和多重PCR鉴定

按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明，提取分离纯化菌株DNA作为PCR模板。细菌16S rDNA PCR反应体系为25 μL，2×TaqMaster Mix 13 μL，上下游通用引物各1 μL，ddH2O 8 μL，DNA模板2 μL；多重PCR反应体系为50 μL，2×TaqMaster Mix 25 μL，α、β、ε、ι毒素引物各1 μL，ddH2O 15 μL，DNA模板2 μL；PCR产物取7 μL进行琼脂糖凝胶电泳，剩余产物送武汉擎科生物技术有限公司测序，将序列结果上传至https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行序列比对。琼脂糖凝胶电泳结果显示，分离纯化株的16S rDNA的扩增条带都在1 500 bp左右(图7A)，序列比对表明分离株16S rDNA序列与产气荚膜梭菌基因组序列相似度达98.06%；多重PCR琼脂糖凝胶电泳结果显示，只在325 bp左右出现条带(图7B)，未见其他长度条带，序列比对结果与MH900562.1同源性达99.65%。

图7 细菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳

4 药敏结果

无菌操作吸取纯化培养后的菌液100 μL，接种于强化梭菌琼脂培养基上，并用棉签涂布均匀，用镊子夹取10种抗生素的药敏片贴于培养基表面，置于43 ℃条件下厌氧培养18～24 h后，测量其抑菌圈直径，判断该菌株的耐药性特点。结果显示，该菌株对青霉素、氨苄西林、四环素、多西环素、氯霉素、红霉素敏感，对新霉素、庆大霉素、卡那霉素、复方新诺明敏感性较差。

5 诊断结果与防治

根据临床症状，组织涂片镜检、病理组织切片观察、细菌分离培养和染色镜检、生化鉴定、细菌16S rDNA鉴定和多重PCR鉴定，最终确定本次麋鹿死亡是由A型产气荚膜梭菌感染引起。

因麋鹿产气荚膜梭菌病发病急，病程短，且野生麋鹿警觉性较高，较难捕获，所以本案例并未针对麋鹿个体进行治疗，而是采用划区分隔饲养，加强饮水消毒，添加药物于补饲饲料中的方法预防健康种群的发病，最终遏制了该病的进一步蔓延。

6 建议

麋鹿产气荚膜梭菌病通常由A型或E型产气荚膜梭菌引起[3]，该病的发病率较高、病程短，从发病到死亡只需几个小时，病死率受温差影响较大[4]，且由于野生动物本身特性，疫病防治主要原则为“预防为主，防重于治”[5]。要做好该病的预防工作，首先应当加强饲养管理，对发病鹿应及时采取隔离措施，防止急病进一步蔓延。针对发病个体，可根据药敏试验结果，选用青霉素、氯霉素等药物进行治疗，选用大剂量青霉素类和磺胺类药物有一定疗效，临床上投服磺胺甲基异唑片能收到良好效果[6]。对于未发病动物，可使用人工制成的饲料进行补饲，在饲料生产的过程中，添加一些药物或益生菌制剂可预防本病的发生，而且补饲的饲料中营养更全面，能够增强麋鹿对疾病的抵抗能力。在该病高发的冬春季节，更换饲料种类时应采取逐步过渡的方法，使得麋鹿瘤胃和肠道微生物菌群变化与食物变化相适应[7]。定期对麋鹿群经常活动区域和区域内积水进行消毒，对病死麋鹿及其排泄物、分泌物作无公害处理，焚烧后表面覆盖生石灰深埋处理等。