亚洲黑熊冬眠前后生理生化差异

王建锋 杜海荣 张明海

(东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040)

冬眠是一些动物在冬季长时间不活动、不摄食而进入睡眠状态，并伴随着体温和新陈代谢速率降低的一种越冬对策[1]。除了外部长期蛰伏的冬眠表现，在内部生理方面还通过降低体温、新陈代谢速率，利用体内激素如脂联素、胰岛素等改变能量转化方式及路径，提高能量利用效率的同时减少能量消耗[2]。冬眠期间，绝大多数动物不进食，仅依靠身体储备的脂肪来满足能量需求。冬眠生理学离不开对动物体内能量底物的研究，而检验能量底物利用的一种重要方法是测量能量代谢过程中相关物质的含量或活性，如甲状腺激素、瘦素及其受体等[2]。国内外的冬眠生理研究多集中于小型物种，如十三线地松鼠(Ictidomystridecemlineatus)、达乌尔黄鼠(Spermophilusdauricus)、小棕蝠(Myotislucifugus)[3-5]等，而针对大型兽类的冬眠生理研究相对较少，仅见棕熊(Ursusarctos)冬眠期间代谢调节的研究[6]、美洲黑熊(U.americanus)冬眠前和冬眠期的甲状腺激素水平研究[7]等。

亚洲黑熊(U.thibetanus)，简称黑熊，是栖息在森林中的大型食肉目(Carnivora)动物，分布和活动范围较广。在冬季的北方地区，由于气候寒冷和冰雪覆盖，使食物来源较为匮乏，黑熊演化出冬眠机制以应对恶劣的环境。熊科(Ursidae)动物是生物多样性保护的旗舰物种，为探究黑熊在冬季的生理状况以及冬眠期间保持能量平衡的生理因素，于2020年11月—2021年3月在黑龙江省哈尔滨市山河实验林场开展黑熊冬眠试验，通过对冬眠前后的粪便样品进行测定，分析与冬眠相关的生理生化指标变化，试图探究其冬眠前后能量利用、新陈代谢相关的生理因素及其生理机制，藉此为黑熊野外种群保护提供科学依据，亦可能为医学发展和疾病治疗提供基础数据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

在黑龙江省哈尔滨市山河实验林场开展试验，选取5只健康无病的黑熊成体，其中成年雄性2只、成年雌性3只，体重116～134 kg。冬眠试验期间，开设单独室内笼舍，并与其他黑熊分开饲养。黑熊的喂养饲料由玉米面、奶粉、蜂蜜和猪肉(及肉汤)等食物组成，每天进食2次，分别是08：00和15：00，并提供自由饮水条件。

1.2 试验过程

1.2.1 育肥

2020年11月，配合野外黑熊育肥情况，给试验黑熊增加喂食高脂质食物(蜂蜜、猪肉及肉汤)，在体重显著增长后再逐渐减少喂食直至停食。模拟野外冬眠环境，笼舍中不供应暖气，开窗通风使得室内温度保持在-5～-15 ℃，同时铺设稻草等基础保暖材料于笼舍内。

1.2.2 冬眠

2020年12月，黑熊进入蛰伏的冬眠状态，不活动、不进食、不排泄，期间禁止任何人为活动干扰。

1.2.3 出眠

经过90～100 d的冬眠，试验黑熊在2021年3月逐渐恢复活动状态，苏醒出眠。

1.3 采样与保存

黑熊等大型兽类性情凶猛，以往的相关生理研究多使用血液采样，通常需要提前进行麻醉。麻醉剂的使用可能对动物体的正常生理生化造成影响，剂量不当还可能导致动物呼吸抑制、器官损伤等不良反应，严重情况下可能致死[8-9]；麻醉取血需要专业的技术操作，同时也存在一些伦理问题，使用非损伤性(排泄物)采样替代血液采样，能够很大程度降低对试验动物的不利影响[10]。本研究于黑熊冬眠前后分别采集5 d的排泄物样品，进行测定和分析。测定指标多为物理性质较为稳定的蛋白类物质(表1)，挥发性弱或难以挥发，既避免了麻醉对黑熊的应激影响，又保证了样品能够在相当程度上反应指标的变化趋势。笼舍架有监控相机进行全天候记录，配备人员定时喂养和观察。同时，配置温湿度记录仪，记录室内的温湿度变化情况。

1.3.1 样品收集

准备5个带有滤网的40 cm×40 cm收集器皿，分别置于5只黑熊笼舍下方，于每日傍晚收集当天的新鲜粪样，进行简单过滤后暂存采样袋中。

1.3.2 样品保存

向过滤后的粪样加入磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)以维持生物活性，将处理后的样品分为2份，每份10 g，装入新的采样袋并标记，放入冰箱-20 ℃保存。

1.4 试验方法

根据国内外已有冬眠生理研究，筛选了36项与冬眠过程、能量代谢等相关的生理生化指标，将5只黑熊的20份样品(冬眠前后各选取10份)进行试验。根据不同物质的特性，分别采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)和微量法进行测定，由江苏酶标生物科技有限公司和苏州科铭生物技术有限公司提供技术服务，测定指标及对应测定方法详见表1。

表1 黑熊冬眠前后生理生化指标的测定方法及数据分析结果

1.4.1 酶联免疫吸附测定法——以甲状腺素测定为例

用纯化的甲状腺素捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入甲状腺素，再与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的检测抗体结合，形成抗体—抗原—酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物四甲基联苯胺(3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，TMB)显色。TMB在HRP的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成黄色。颜色的深浅和样品中的甲状腺素浓度呈正相关。用Rayto酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中甲状腺素浓度。

1.4.2 微量法——以葡萄糖测定为例

葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并产生过氧化氢；过氧化物酶催化过氧化氢氧化4-氨基安替比林偶联酚，生成有色化合物，在505 nm有特征吸收峰，其颜色深浅与葡萄糖摩尔浓度成正比。

1.5 数据分析

根据采样时间，将试验数据分为冬眠前和冬眠后，运用SPSS软件进行数据分析。先用描述性统计进行均值和标准差计算，后进行正态性检验，再根据结果进行显著性检验。若2组数据都服从正态分布且方差齐性采用参数检验(t检验)，不服从正态分布或方差不齐性进行非参数检验(秩和检验)[11-12]，通过显著性检验分析冬眠前后的2组数据是否存在显著差异。

2 结果与分析

2.1 冬眠前后的指标差异

在36项指标中，葡萄糖、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇5项指标水平在冬眠前高于冬眠后，其余31项指标水平在冬眠前均低于冬眠后(表1)。

2.2 秩和检验

由于2组数据不服从正态分布或方差不齐性，故采用秩和检验。在秩和检验中，当P<0.05时，说明2组数据存在显著差异；当P<0.01时，说明2组数据存在极显著差异，当P>0.05时，说明2组数据不存在显著差异。从表1可知，甲状腺激素等12项指标在冬眠前后出现显著变化，其中，甘油三酯等4项指标在冬眠前后的差异极显著，褪黑激素等24项指标在冬眠前后则无显著差异。

3 讨论

3.1 脂质利用

甘油三酯是一种重要的脂质，水解后形成游离脂肪酸和甘油以供能量消耗。动物在冬眠时会对体内新陈代谢进行广泛调整，通常包括抑制碳水化合物的分解，并在冬眠期间从利用碳水化合物转变为依靠脂质氧化提供能量[13]。在对达乌尔黄鼠的研究中发现，其冬眠前肥育期甘油三酯的水平比冬眠期和苏醒期均高[4]。黑熊在育肥期间会摄入大量高脂肪食物，为冬眠囤积能量储备，甘油三酯处于最高的水平。由于在冬眠期间消耗了身体的脂肪储备，冬眠后黑熊的甘油三酯极显著低于冬眠前的水平(P<0.01)。

过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPAR-α)是一类转录因子，参与调节脂质的代谢，维持脂质稳态。在PPAR-α的刺激下，甘油三酯在脂肪代谢中会变得更为高效，PPAR-α的增加与甘油三酯的降低存在相关[14]。本研究中，黑熊的PPAR-α水平在冬眠后极显著高于冬眠前(P<0.01)，其与甘油三酯水平呈负相关。

3.2 糖类利用

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的激活可以减少葡萄糖的生成，黑熊在冬眠期间主要依靠消耗脂肪储备来维持身体机能，需要提高AMPK水平以减少葡萄糖的生成与消耗。冬眠前尚未进入蛰伏状态，AMPK水平较低，而在冬眠苏醒后体内AMPK水平仍较冬眠前高(P<0.05)，则是冬眠机制的延续[15]。

碱性磷酸酶是一种膜结合糖蛋白，在碱性pH下催化单磷酸酯水解，参与了葡萄糖和脂肪酸在肠道内的主动转运，还帮助葡萄糖通过肾脏复杂小管的吸收。冬眠时碱性磷酸酶活性在大部分器官中均显著增加，高于冬眠前的水平[16]。出于冬眠苏醒后黑熊对恢复生长的需求，碱性磷酸酶质量浓度在一段时间内仍会保持较冬眠前高的水平(P<0.01)。

3.3 能量平衡

瘦素主要由脂肪组织产生和分泌，通过给下丘脑传递关于体脂和能量平衡的信息，充当能量平衡的反馈控制器，其质量浓度通常和身体肥胖相关[17]。当瘦素增加时，身体基础代谢率(basal metabolic rate，BMR)降低，产热能力和棕色脂肪组织的质量也会随之增加[5]。冬眠前较高的甘油三酯水平联动瘦素抵抗，导致瘦素水平较低[18]，而冬眠期及苏醒期黑熊的瘦素水平较高(P<0.05)则是为了降低BMR，有利于节约能量消耗。

饥饿素主要产生于胃内的分泌细胞，是下丘脑神经元回路的神经递质。研究发现，在冬眠哺乳动物中，饥饿素可能对食物摄入和体重调节有重要作用。饥饿素的水平往往会随着动物禁食而增加，金背黄鼠(Spermophiluslateralis)在经过5 d的禁食后饥饿素水平明显上升[19]，试验黑熊在冬眠禁食后的饥饿素水平同样也较冬眠前高(P<0.05)。黑熊在苏醒出眠后，相对较高的饥饿素水平有促进摄食的作用，帮助身体尽快恢复到正常状态。

由于黑熊在冬眠期间几乎不进行排泄，抗利尿激素的分泌可以抑制排尿反应，从而减少身体水分和其他物质的流失。在冬眠刚结束的时期，黑熊体尚未完全恢复到正常状态，进食和排泄还未完全恢复正常，抗利尿激素水平依旧较高(P<0.05)。由于排尿少，黑熊冬眠后的尿酸水平自然也较冬眠前高(P<0.05)。

3.4 入眠与苏醒

甲状腺素由甲状腺产生和储存，具有协调动物体生长和代谢的重要作用。在冬眠前直至冬眠后期甲状腺素会持续下降，通过抑制新陈代谢，为冬眠期间的低体温做准备；而在出眠苏醒后，体温和活动随之恢复[10]，黑熊的甲状腺素水平上升(P<0.05)。促甲状腺素释放激素(TRH)由下丘脑产生，可刺激促甲状腺激素的合成，从而促进甲状腺素的分泌。在冬眠前期TRH缺乏、刺激甲状腺功能减弱，而冬眠苏醒后黑熊体内的TRH水平升高(P<0.05)，其变化与甲状腺素基本一致。

胰岛素是一种由胰脏分泌的具有降低血糖作用的激素，临床常用于治疗糖尿病，还能促进糖原、脂肪、蛋白质等物质合成。在冬眠后期至冬眠苏醒时期，十三线地松鼠的胰岛素分泌会随着体温上升而逐渐增加，在体温稳定到正常水平后会下降[3]，黑熊亦有着相似的变化趋势。冬眠后，黑熊体内的胰岛素水平升高(P<0.05)，这有利于黑熊短时间内恢复正常的身体状况。

脂联素是参与能量代谢的重要脂肪因子，研究发现其与能量平衡、胰岛素敏感性有关，可以刺激产热，并通过刺激脂肪酸氧化诱导体重和脂肪量减少[20]。脂联素会与3种受体结合，其中之一便是脂联素受体2。脂联素受体2会导致胰岛素敏感性的增加，在体质偏瘦的小鼠体内检测到更高的水平[21]。在冬眠期间，黑熊消耗了大量脂肪贮备，苏醒后体重减轻，急需提高胰岛素水平和体温来恢复正常活动，故试验中黑熊的脂联素受体2水平冬眠后极显著高于冬眠前(P<0.01)。

除本研究检测的指标外，还有一些对动物冬眠有重要影响的物质，如下丘脑室管膜胶质细胞(tanycytes)，可检测来自外周的代谢产物和内分泌信号，并调节这些成分从血液到大脑的运转，属于冬眠内源性节律调节者[22]。但以往试验需要在小型鼠类的(脑部)组织进行，目前受条件所限，难以在大型兽类活体内测量，故本研究未涉及。

3.5 结论

在黑熊冬眠试验中，分析了2个时期生理生化的差异和变化。由于瘦素、饥饿素、胰岛素等激素的协调、能量底物甘油三酯的增多，以及其他信号分子的刺激，黑熊得以在长期蛰伏和禁食下保持基础生命活动，从而顺利越冬。对黑熊冬眠的生理适应研究，有助于进一步揭示动物的冬眠机制，深入分析冬眠背后的生理、环境因素，结合栖息地生态研究，可以更好地为保护这些物种及其生存环境提供借鉴。

致谢：感谢黑龙江省哈尔滨市山河实验林场的段洪伟场长及工作人员在试验期间提供的支持和帮助。