急性淋巴细胞白血病患者外周血A KT信号通路关键蛋白的磷酸化和Netrin-1蛋白表达水平及意义

鲁潇，史芳瑜，李雅钦

（1.南阳市中心医院急诊内科；2.南阳市第一人民医院肿瘤实验室；3.南阳市中心医院综合治疗室，河南 南阳 473000）

急性淋巴细胞白血病 （Acute lymphoblastic leukemia，ALL）是由于原始淋巴细胞在造血组织中异常增殖并浸润各组织器官的恶性克隆性疾病，本病常见于儿童，临床主要表现为面色苍白、疲劳无力、皮肤瘀点及鼻出血等[1-3]。目前，ALL发病机制尚未完全明确，可能与病毒感染、免疫功能异常、物理及化学等因素有关。近年来，随着医学技术不断发展，ALL的治愈率得到提高，但部分亚型患者仍缺少相关治疗手段，既往研究显示[4]，ALL中相关细胞的生长、转录存在多种信号通路的异常，故对相关信号通路进行分析研究对临床选择合适治疗手段意义重大，可提高患者治愈率。外周血丝/苏氨酸激酶（Serine/Threonine kinase，AKT）信号通路在多种恶性肿瘤的发生发展中被异常激活后，导致患者预后较差[5]。神经导向因子1(Neurodirecting factor 1，Netrin-1)不仅在神经细胞的迁移、凋亡中发挥重要作用，在非神经组织的分化中也有参与，与ALL的发生发展密切相关[6-7]。因此，本文旨在探讨ALL患者外周血AKT信号通路关键蛋白的磷酸化及Netrin-1蛋白的表达意义，以期为临床治疗提供新的参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年6月至2020年6月于本院确诊的92例ALL患者作为观察组，另选取同期在本院进行体检的健康者92例作为对照组。纳入标准：（1）符合ALL诊断标准[8]；（2）本研究经医院伦理委员审核批准通过，患儿监护人了解且知情同意。排除标准：（1）存在重要脏器病变者；（2）存在精神障碍者；（3）存在其他感染疾病患者；（4）存在免疫系统疾病患者。观察组男52例，女40例，年龄2～9岁，平均（5.54±1.67）岁，身体质量指数（Body Mass Index，BMI）10.25～15.70 kg/m2，平均（12.48±0.59）kg/m2；对照组男47例，女45例，年龄2～9岁，平均（5.31±1.42）岁，BMI 10.25～15.70 kg/m2，平均（12.72±0.59）kg/m2。两组患者年龄、性别及BMI等一般资料无显著差异（P＞0.05）。

1.2 检测方法

1.2.1 治疗方案 所有ALL患者均采用常规输血、抗感染及水化等基础治疗，并使用CCLG-ALL-2008化疗方案，28 d为一个疗程。

1.2.2 血常规检测 在患者入院时，采用SYSMEXXE-2100D全自动血细胞分析仪检测患者外周血血常规，包括白细胞计数（White blood cell count，WBC）、血红蛋白（Hemoglobin，Hb）、血小板（Blood platelet，PLT）等。

1.2.3 炎症因子 在患者入院时，于清晨采集所有患者空腹静脉血2 mL，静置30 min待血液分离出血清后，经离心（10 min，3 000 r/min）后取上层清液，放置于-20℃条件下保存。使用免疫比浊法检测血清C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、降钙素原（Procalcitonin，PCT）水平，试剂及试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。使用酶联免疫吸附 试 验 法 （Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测白细胞介素-6（Intedeukin，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α），仪器选择美国Bio-Rad i Mark680多功能酶标检测仪，试剂及试剂盒为仪器配套的，检测步骤按照说明书执行。

1.2.4 Netrin-1水平的检测及Western blot检测AKT、P-AKT信号通路表达 于治疗结束时采集所有患者空腹静脉血2 mL，静置30 min待血液分离出血清后，进行离心（10 min，3 000 r/min）处理，取上层清液放置于-20℃条件下保存。采用ELISA检测Netrin-1水平。试剂及试剂盒购自武汉益普生物科技有限公司，操作步骤严格按照操作说明书进行。先通过密度梯度离心法分离单个核细胞，再采用RIPA细胞裂解液提取单个核细胞总蛋白，经BCA蛋白测定试剂盒（艾美捷科技有限公司）检测蛋白质浓度。将蛋白质利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后电子转移到聚偏二氟乙烯膜，加入质量分数5%的脱脂奶粉并密封2 h。依次加入一抗（1×TBST稀释至1∶1 000），在4℃环境中孵育过夜，使用TBST缓冲液洗膜3次，8min/次，使用辣根过氧化物酶偶联的二抗（1×TBST稀 释 至1∶20 000，Abcam；1×TBST稀 释 至1∶20 000，Sigma-Aldrich）孵育膜，室温孵育1 h，使用TBST缓冲液洗膜3次，10 min/次，电化学发光显影，选用β-actin作为内参，利用凝胶成像系统分析对比条带强弱。

1.3 随访 患者于治疗后的1年内每3个月进行门诊复查，随访截止时间为2021年6月，期间记录患者复发情况、生存时间及随访时状态（存活、死亡或其他）等。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0软件对本研究内容数据进行处理，满足正态分布的计量资料均以均数±方差（±s）表示，组间差异比较使用两样本独立t检验；计数资料均以n或%表示，组间差异比较采用χ2检验；采用Graphpad prism 5.0分析生存资料，采用Kaplan-Meier曲线进行生存分析，比较采用Log-rankχ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者血常规比较 观察组WBC水平显著高于对照组，PLT、Hb水平显著低于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 两组患者血常规比较（±s）

表1 两组患者血常规比较（±s）

组别 n观察组对照组92 92 t P W BC（×109/L）P L T（×109/L）10.89±0.82 8.62±0.75 19.593＜0.001 187.47±8.25 252.43±20.37 28.351＜0.001 Hb（g/L）134.35±14.82 147.67±15.32 5.994＜0.001

2.2 两组患者炎症因子比较 观察组CRP、PCT、IL-6、TNF-α水平显著高于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 两组患者炎症因子比较（±s）

表2 两组患者炎症因子比较（±s）

组别观察组对照组n 92 92 t P CRP（mg/L）12.89±0.82 8.62±0.75 36.855＜0.001 PC T（μg/L）I L-6（ng/L）7.47±1.25 0.43±0.09 53.881＜0.001 32.68±8.65 5.47±1.21 29.881＜0.001 T N F-α（ng/L）13.53±2.58 7.25±1.21 21.138＜0.001

2.3 两组患者Netrin-1水平、AKT、p-AKT信号通路表达水平 观察组患者Netrin-1水平、AKT、p-AKT蛋白表达水平均显著高于对照组（P＜0.05）。见表3、图1（Netrin-1水平、AKT、p-AKT蛋白结果来自所有患者，图片来源于其中一个患者）。

图1 两组患者的Netrin-1水平、AKT、p-AKT蛋白表达水平

表3 两组患者Netrin-1水平、A KT、p-A KT信号通路表达水平

2.4 Netrin-1水平的表达与ALL患者预后分析ALL患者中Netrin-1高表达水平生存率为76.09%，显著低于低表达水平的84.78%，差异有统计学意义（Log-rankχ2=3.240，P=0.037）；ALL患者中Netrin-1高表达水平无病生存率为45.65%，中位生存期为7.52个月，显著低于低水平表达患者（50.00%，10.02个月），差异具有统计学意义（Logrankχ2=7.792，P=0.005），见图2。

图2 Netrin-1水平的表达与ALL患者预后分析

3 讨论

ALL属于一种造血系统的恶性疾病，多发于小儿。近年来，随着医学技术的不断发展，ALL5年生存率可达80%[9]，但部分患者预后仍较差，故寻找新的相关因素和靶点对ALL的治疗十分重要。AKT在人体中的作用较为广泛，在多个信号通路中起重要作用，有利于维持细胞正常功能，可利用磷酸化作用产生相应的变化来应对环境改变[10]。Netrin-1作为Netrin家族的一员，在多种肿瘤细胞中均存在缺失或高表达现象，可促进癌细胞的发生发展[11]。且既往研究显示[12]，Netrin-1可通过激活整合蛋白（Integrin）受体，调控AKT信号通路，从而影响细胞的增殖、分化过程。因此，本文研究了ALL患者外周血AKT信号通路关键蛋白的磷酸化和Netrin-1蛋白表达水平及意义。

WBC是机体防御组织重要的组成部分，可吞噬异物并产生抗体，抵抗病原体入侵及具有相应的自愈能力[13]。PLT可保护毛细血管的完整性，有助于临床上帮助判断止血和血栓性疾病。Hb是一种胞浆内的蛋白质，负责将氧气从肺运输到身体其他组织。TNF-α主要由巨噬细胞分泌，具有防御病原体、抑制肿瘤的发生、免疫调节和诱导炎症介质等作用。IL-6是一种功能广泛的多效性细胞因子，可调控多种细胞的生长与分化，具有急性期反应和造血功能等作用，在机体的抗感染免疫反应中起重要作用；PCT是一种蛋白质，其在机体中的含量与严重感染及多脏器功能衰竭严重程度密切相关，CRP是一种急性蛋白，可激活补体、加强吞噬细胞的吞噬的调理作用，且能够对细菌和病毒感染的进行鉴别。本研究结果显示，观察组WBC、CRP、PCT、IL-6、TNF-α水平显著高于对照组，PLT、Hb水平显著低于对照组，这可能是由于ALL患者机体受到病毒或细菌感染后，促进免疫炎症反应的发生及WBC水平的升高，可诱导多种炎症因子表达量升高，从而使细胞受到损伤，加重ALL患者临床症状。

本研究结果显示，观察组患者Netrin-1水平、AKT、p-AKT蛋白表达水平均显著高于对照组。AKT又称之为蛋白激酶 B （Protein kinase B,PKB），AKT信号通路作为细胞内信号转导的重要环节，参与细胞增殖、分化、凋亡和免疫调节等多种生理过程[14]。因AKT在N端调节区域含有普列克底物蛋白同源物（Pleckstrinhomology，PH）结构域，PH结构域是一种功能性区域，存在多种信号蛋白和细胞骨架相关蛋白，而血小板内主要的PKC的底物普列克底物蛋白（Pleckstrin）中的一段重复序列与AKT具有同源性，可导致蛋白质-蛋白质的相互作用[15-16]。近年来相关研究表明[17]，AKT的异常活化与ALL的发生、发展及转移密切相关。观察组AKT、p-AKT蛋白表达水平高于对照组，提示AKT信号通路关键蛋白的磷酸化参与ALL病理机制的发生，在激活炎症反应中具有重要作用。AKT蛋白在磷脂酰肌醇-3-羟基激酶（Phophatidylinsotitol-3-kinase，PI3K）作用下被充分激活，使AKT发生磷酸化，调控炎症介质基因转录过程，从而使患者病情加重。既往研究显示[18]，Netrin-1可增强白血病细胞的增殖能力，在多种癌细胞中存在高表达，且转移性强，观察组Netrin-1水平高于对照组，说明Netrin-1可能参与ALL发生过程。此外，有学者认为[19]，Netrin-1可能通过激活AKT信号通路来促进白血病细胞的增殖与分化，进而使免疫炎症反应紊乱，导致机体出现异常。本研究分析了Netrin-1的表达与ALL患者生存率之间的关系，发现Netrin-1高表达患者的总生存率和无病生存率均显著低于Netrin-1低表达，表明Netrin-1与ALL疾病的发展密切相关，可作为预后相关分子标识物。

综上所述，ALL患者外周血中的Netrin-1蛋白表达水平存在异常，可能通过调控AKT信号通路，使炎症反应加重，从而促进ALL患者病情加重，且Netrin-1高表达患者的总生存率及无病生村率均显著低于Netrin-1低表达患者。