批分析（多管同测）法超敏检测低浓度乙型肝炎病毒核酸

斯志娟，雷震

（南昌大学附属感染病医院 南昌市第九医院，江西 南昌 330002）

人类非自限性病毒感染性疾病的病因学治疗手段有限，目前，大多依赖核苷（酸）类似物破坏病毒（逆）转录，干扰或终止病毒核酸的合成，达到抗病毒的作用。如HBV[1]、HCV[2]、HIV[3]等。核苷（酸）类似物不能清除病毒，但可通过长期抑制病毒复制，耗尽病毒库的方式，达到清除病毒的目的。核苷（酸）类似物治疗的理想停药时机是体内病毒库被耗尽，这就促使临床对核酸检测灵敏度无限高的期望（检测下限无限地接近于0）[4]。有研究证实[5]，抗HBc阳性的隐匿性HBV感染的献血者血液中含有0.15 IU/mL的HBV DNA，即可导致受血者感染。当前临床检测技术采用磁珠法富集核酸[6-7]，以提高原始样本扩增量。数字PCR技术[8]采用流体芯片或微滴技术等方式分配成单拷贝靶核酸扩增，通过计数阳性孔数目的方式进行核酸绝对定量检测。我们采用批分析（多管同测）法对低浓度（载量）样本进行核酸扩增检测，以期建立一种新的低浓度（载量）核酸检测方法。

1 材料与方法

1.1 样本来源 我院就诊患者HBV DNA检测后剩余血清约1.5 mL，检测结果约2×103IU/mL。

1.2 仪器功与试剂 SlAN-96S全自动医用PCR分析系统（上海宏石医疗科技有限公司）。乙型肝炎病毒核酸实时荧光定量PCR检测试剂（批号：2021019，圣湘生物科技股份有限公司）；核酸释放剂（批号：2021019，圣湘生物科技股份有限公司）；细胞保存液（批号：12021003，圣湘生物科技股份有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 将上述样本分装在离心管中-20±5℃冷冻保存，每管130μL。

1.3.2 梯度浓度样本盘的选择 取一份样品用细胞保存液稀释成1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000的梯度浓度样本，用乙型肝炎病毒核酸实时荧光定量PCR检测试剂扩增检测上述梯度浓度样本，各平行检测3管。

取三管均阳性的最低浓度（1∶100）样本，再用细胞保存液稀释成1∶100、1∶200、1:400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600的梯度浓度样本，然后用乙型肝炎病毒核酸实时荧光定量PCR检测试剂扩增检测该梯度浓度样本，各平行检测10管，选择全部阳性的最低浓度样本为S1（1∶200）、然后依次S2（1∶400）、S3（1∶800）、S4（1∶1 600）、S5（1∶3 200）、S6（1∶6 400）、S7（1∶12 800）形成梯度浓度样本盘。

1.3.3 梯度浓度样本盘的检测 用乙型肝炎病毒核酸实时荧光定量PCR检测试剂检测上述梯度浓度样本盘S1～S7，每批各样本平行测10管，每天检测4～6批，共计检测20批次。

每一批次设定量参考品4个（A：4×107IU/mL、B：4×106IU/mL、C：4×105IU/mL、D：4×104IU/mL）、阳性对照和阴性对照各1个。

1.3.4 质量控制 （1）乙型肝炎病毒（HBV）阴性对照：无Ct值显示；但乙型肝炎病毒（HBV）-内标检测为阳性（Ct≤40）；（2）乙型肝炎病毒（HBV）阳性对照：检测浓度介于1.26×105-1.26×106IU/mL；（3）四个乙型肝炎病毒（HBV）定量参考品均检测为阳性，且标准曲线相关系数|r|≥0.98；（4）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本批次实验无效。

1.3.5 阳性判断标准 检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40，判断为阳性。

1.3.6 批分析阳性与批分析阴性 批分析阳性，批分析中至少有一管阳性即该批分析阳性。批分析阴性，批分析中无阳性管即该批分析阴性。

1.3.7 1copy/管Ct变异区间确定 上述实验中，选择所有批次检测中无Ct值检测管＞20%的各浓度水平阳性管Ct集合，按偏态分布90%CI确定为1copy/管Ct变异区间。

1.4 统计学处理 采用永中Excel进行数据及图表处理。计数资料采用百分率，计量资料采用（±s），精密度采用CV。1copy/管Ct分布区间的确定采用偏态分布90%CI。

2 结果

2.1 乙型肝炎病毒核酸实时荧光定量PCR检测试剂基本信息 乙型肝炎病毒核酸实时荧光定量PCR检测试剂扩增循环参数，见表1。样本释放剂5μL加样本5μL,用移液器吸打3～5次混匀，静置10 min后，加入PCR混合液（乙型肝炎病毒核酸PCR反应液38μL加酶混合液2μL加内标0.2 μL）上机扩增。检测通道FAM；内标通道VIC；参比通道ROX。

表1 乙型肝炎病毒核酸实时荧光定量PCR检测试剂扩增循环参数

2.2 质量控制 各检测批次阴性对照均阴性且内标为阳性（Ct＜40），阳性对照结果1.4244～4.5304×105IU/mL，四个乙型肝炎病毒（HBV）定量参考品均检测为阳性，且标准曲线相关系数|r|=0.99684～1。阳性对照、定量参考品测定管Ct统计，见表2。

表2 阳性对照、标准品C t统计

2.3 1copy/管Ct分布区间确定 所有批次检测中无Ct值检测管＞20%的各浓度水平（S3～S7）阳性管Ct集合，见图1。以S3～S7阳性管Ct集合为样本，按偏态分布90%CI确定的1copy/管Ct变异区间为38.24～40。

图1 所有批次检测中无Ct值检测管＞20%的各浓度水平（S3～S7）阳性管C t集合(升序折线图）

2.4 各浓度各批次阳性测定管数统计 S1～S7单管检测阳性检出率分别为：92%、71%、35%、25.5%、12%、6%、4.5%，批分析阳性检出率分别为：100%、100%、85%、90%、60%、40%、40%。见表3。

表3 各浓度各批次阳性测定管数统计

3 讨论

本研究中，1 copy/管Ct变异区间指的是每支扩增管中只有1 copy靶核酸时扩增的Ct变异分布范围。此时的Ct变异不表示进入扩增管靶核酸的多寡，而是表达核酸扩增及扩增效率的随机性。因此，在临床检测中，当Ct处于1 copy/管Ct变异区间时，不应用常规的标准曲线法定量，而应当以1copy/管的方法定量，此方法与数字PCR类似[9]。影响核酸扩增效率的因素较多，包括试剂因素、靶核酸因素及仪器因素等。因此，建议1 copy/管Ct变异区间应由各临床实验室实验确定。

在确定1 copy/管Ct变异区间时，应尽量避免或减少将非1 copy/管Ct变异区间的Ct纳入。为此，本研究采用了两种措施（1）以所有批次检测中无Ct值检测管＞20%的各浓度水平阳性管Ct集合为样本，（2）选用偏态分布90%CI。本研究显示，选择S3～S7阳性管Ct集合为样本的1 copy/管Ct变异区间为38.24～40。

本研究用常规的方法检测低浓度（载量）核酸样本，当样本浓度低于试剂检测下限时，采用单管检测可能不是每一次都有靶核酸进入扩增体系，若采用批分析（多管同测）法，每增加一管，被检测的样本总量都相应的增加，靶核酸被检出的概率也就相应地增加。结果显示，本研究S1～S7单管检测阳性检出率分别为：92%、71%、35%、25.5%、12%、6%、4.5%，批分析阳性检出率分别为：100%、100%、85%、90%、60%、40%、40%。

低浓度（载量）核酸样本，采用批分析（多管同测）法检测，在不改变单管扩增体系环境的条件下，增加了实际扩增分析的样本总体积，从而提高了分析的灵敏度，具有更高的阳性检出率。批分析检测管数的选择可根据实际需求个性化确定。现有的超敏核酸检测场景，多采用富集核酸的技术制备核酸模板，需要使用专用设备及试剂。本研究方法采用常规核酸检测试剂，无需专用设备，可提高基层检测单位的超敏检测需求的可及性。在已有超敏核酸检测场景的实验室，在此基础上，采用该多管同测扩增检测的技术可达到更高的灵敏度。在有超敏检测需求的患者，如核苷（酸）类似物治疗终点选择时可以采用该研究方法，为治疗终点抉择提供更为灵敏的参数支持。该研究方法主要用于临床低浓度（载量）核酸样本检测，样本无需稀释，只要同时检测多管。

本研究中，所有批次检测中，标准品相关系数|r|在0.99684～1之间波动，单个测定点Ct的CV小于1%，阳性对照Ct的CV小于1%，阴性对照均阴性，表明在常规检测浓度区域（中、高浓度区域），试剂性能稳定，结果重复性好，与相关研究一致[10]。在该浓度区域，单管检测能满足临床需求，无需多管检测。

综上所述，实验室应实验确定各核酸定量项目的1 copy/管Ct变异区间；当Ct处于1 copy/管Ct变异区间时，不应用常规的标准曲线法定量，而应当以1copy/管的方法定量；采用批分析（多管同测）法检测低浓度（载量）核酸样本可提高阳性检出率。当然，该方法还需要在大量的临床检测中验证。另外，批分析（多管同测）法是一种样本处理方法，广泛适用于核酸扩增检测的诸多领域，其在丙型肝炎病毒核酸检测、人类免疫缺陷病毒核酸检测、循环核酸肿瘤标志物检测等有超敏检测需求的各领域，也有待于广泛的临床检测验证。