PEG胁迫下旱地油菜绿肥苗期抗旱性筛选和评价

张达斌，黄文凤，惠 蕾，张东亮，李志琴，陈 姣，付 蓉，王朝辉，曹卫东，高亚军*

（1 西北农林科技大学资源环境学院，陕西杨凌 712100；2 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081；3 农业农村部西北植物营养与农业环境重点实验室，陕西杨凌 712100；4 中国农业大学资源与环境学院，北京 100083）

黄土高原种植制度传统上大都为一年一熟或两年三熟，拥有较为广阔的(约两百多万hm2)夏季裸地休闲面积，占该地区耕地面积的40%左右[1]。由于黄土高原地区夏闲期正值雨热同季，期间光热水资源充足，而夏闲期休闲效率较低，一般只有10%～15%，大部分休闲期的降雨并没有及时存储于土壤中而无效损失[2]。长年以来，由于不合理的耕作方式以及降水季节性分布不均匀等诸多因素，黄土高原地区水土流失和耕地质量下降等生态环境问题日益突出，严重制约了当地农业绿色可持续发展。解决以上问题的一个行之有效的方法就是在夏季休闲期间种植绿肥作物。

绿肥是指能翻耕到土壤里用作肥料的新鲜植物的总称。绿肥既是优质、清洁的有机肥源，对改良和培肥土壤作用效果显著，也是可再生的生物资源，可为作物的高产优质奠定基础[3]。我国绿肥资源丰富、分布广泛，目前已发现至少98种适应不同耕作制度及自然条件的绿肥种质资源，其中将十字花科油菜用作绿肥作物有着较广泛的应用前景和市场。相比于其他绿肥品种，油菜具有适应性和抗逆性强，种植地域广，生长期短且播种期宽松，株体高大，鲜草和干物质产量高，发芽出苗性能优良等特点[4]。与紫云英相比，油菜压青作绿肥具有营养均衡、干物质量大等优势。此外，油菜体内含有丰富的硫苷，能有效地杀死有害细菌、虫卵并抑制杂草的发生[5]。盛花期油菜的碳氮比为20～25∶1，有利于土壤微生物将其矿化分解。油菜为直根系作物，根系腐烂后会形成土壤的孔隙，能提高土壤透气性，有利于土壤生化反应、改良耕层物理结构[6]。油菜盛花期还田还可以降低土壤容重，增加土壤孔隙度和有机质、全氮、碱解氮、速效磷及速效钾含量[7−8]。

作为中国典型生态脆弱区和气候敏感区，黄土高原地区近年来夏季干旱频发，干旱面积呈扩大趋势[9]，夏闲期播种的油菜绿肥往往因干旱少雨而导致出苗困难甚至死苗。筛选苗期抗旱能力强的油菜品种，提升其在干旱少雨的夏闲期生存几率，成为油菜绿肥在我国半干旱和干旱地区推广和应用的关键环节之一。因此，本研究利用PEG-6000模拟干旱胁迫环境，采集了30份参试油菜绿肥苗期的根长、芽长和鲜重等数据，对这些品种苗期的抗旱能力进行了系统评价，以筛选耐干旱胁迫的油菜绿肥品种，为黄土高原夏绿肥推广应用及未来抗旱绿肥品种的选育提供一定的理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

参试30份油菜绿肥分别来自于陕西荣华杂交油菜种子有限公司、杨凌农业高科技发展股份有限公司、青海省农林科学院春油菜研究所、甘肃省农业科学院作物研究所和陕西省杂交油菜研究中心，其中24份为甘蓝型油菜改良品种，6份材料为白菜型油菜。其品种名称和基因型见表1。

1.2 试验设计

发芽试验于2018年6月在培养皿中进行，以正常供水为对照，添加10% PEG-6000模拟干旱胁迫环境。采集的油菜绿肥品种共包含30份参试材料(见表1)，共计60个处理，重复3次，随机区组排列。

精选成熟饱满且大小均一的油菜种子各40粒，先用5%的次氯酸钠溶液消毒 5 min，蒸馏水冲洗干净后置于培养皿中，以双层滤纸为芽床，干旱胁迫处理加入PEG-6000溶液10 mL，而对照处理加入等量的蒸馏水，置于25℃恒温培养箱中黑暗培养8天。培养期间采用称重补水法每天按时补水，并定时记录每个绿肥品种种子萌发数和成苗数，种子萌发时间和计数以露白有凸起为标准。培养结束时，在每个培养皿中随机选取15株具有代表性的幼苗，用直尺测量各参试绿肥幼根和幼芽长度，用百分之一分析天平称量其鲜重。

1.3 数据处理与分析

参照孙艳茹等[10]、符明联等[11]、张霞等[12]以及谢小玉等[13]的研究方法，计算成苗率、根芽比(根长∶芽长)、发芽指数、萌发指数、相对活力指数、隶属函数值、各指标的抗旱系数及抗旱指数、综合抗旱指数和加权抗旱指数。其中，抗旱系数和抗旱指数计算公式如下所示：

式中，XS、XC分别为干旱胁迫和对照处理参试油菜绿肥品种各指标的测定值；为该指标在干旱胁迫条件下的平均值。

参试30份绿肥品种培养期间发芽指数和萌发指数计算公式如下所示：

式中，Dt、Gt分别为各油菜绿肥种子发芽天数和第t日发芽数；Gr2、Gr4、Gr6和Gr8分别为第2天、第4天、第6天和第8天的绿肥种子发芽率。

参试30份绿肥品种在培养结束时(第8天)的相对活力指数、隶属函数和综合抗旱指数计算公式如下所示：

式中，BLs、BLc分别为培养第8天干旱胁迫和对照处理油菜绿肥的芽长；SRs、SRc分别为培养第8天干旱胁迫和对照处理油菜绿肥成苗率；Dcmin、Dcmax分别为各指标抗旱系数的最小值和最大值。

根据灰色系统理论，对各指标按照公式(8)进行Z-score标准化，按照公式(9)和(10)计算关联系数和关联度。同时，对参试30份绿肥品种的加权抗旱指数进行聚类分析，划分抗旱能力等级。分析中涉及的计算公式如下所示：

试验数据利用Microsoft Excel 2010进行初步计算和作图，用SPSS Statistics 20.0软件进行处理和统计分析，处理间多重比较采用LSD法。将30份油菜绿肥的综合抗旱指数和干旱胁迫下的7个苗期指标进行灰色关联度分析，研究油菜绿肥苗期萌发特性与抗旱性的相互关系。同时，采用欧式距离和离差平方和(ward linkage)法对品种加权抗旱指数做系统聚类分析，并根据30份油菜绿肥苗期的抗旱能力结果划分成：抗旱能力强、抗旱能力中等和抗旱能力弱 3个等级。

2 结果与分析

2.1 综合抗旱性分析

试验第8天，干旱胁迫条件下参试30份油菜绿肥品种根长介于3.76～18.8 cm，平均11.0 cm，变异系数为23%；芽长介于1.79～4.37 cm，平均2.79 cm，变异系数为15%；根芽比介于1.51～8.85，平均4.04，变异系数为31%；单株鲜重介于15.8～51.2 mg，平均31.5 mg，变异系数为24%。对照条件下，参试30份油菜绿肥品种根长介于1.43～11.5 cm，平均7.63 cm，变异系数为23%；芽长介于2.49～5.22 cm，平均3.71 cm，变异系数为16%；根芽比介于0.32～3.63，平均2.11，变异系数为28%；单株鲜重介于28.5～72.3 mg，平均48.2 mg，变异系数为19%。

由此计算出来的30份油菜绿肥品种综合抗旱指数介于0.30～0.75，极差为0.45，三等分值为0.151(表2)，最终得出参试油菜绿肥不同抗旱等级的综合抗旱指数(CDI)区间，≥0.60为抗旱能力强、≥0.45且<0.60为抗旱能力中等、<0.45为抗旱能力弱。利用该指标对参试30份油菜绿肥进行综合抗旱能力的初步评价，结果显示：甘杂1号(编号13)、陇油8号(编号15)、秦优28号(编号23)、陕油0913号(编号16)、陕油16号(编号30)、青杂11号(编号17)等17份材料评价结果为强抗旱，占参试绿肥品种的56.7%；另有8份油菜绿肥材料综合评价结果为中等抗旱；其余5份材料评价结果为弱抗旱。

表2 参试油菜绿肥品种苗期表现及综合抗旱性评价Table 2 Seedling performance andcomprehensive drought resistance evaluation of the Brassica greenmanure varieties

续表2 Table 2continued

2.2 灰色关联度分析

根据灰色系统理论，将30份油菜绿肥材料的综合抗旱指数和干旱胁迫下的7个指标视为一个整体，即灰色系统。将综合抗旱指数作为母序列，各指标原始数据经公式(8)标准化处理后的值作为子序列，建立灰色系统。由表3可知，在干旱胁迫条件下各油菜绿肥苗期7个测定指标与综合抗旱指数的密切程度(关联序)顺序为：萌发指数>相对活力指数>根长>芽长>发芽指数>鲜重>根芽比，且关联度均在70%以上。总体来看，30份油菜绿肥材料的苗期发芽率和根长受干旱胁迫的影响较大。同时，通过测定干旱胁迫条件下油菜绿肥品种的萌发指数、相对活力指数、根长、芽长、发芽指数、鲜重和根芽比，所筛选获得的70%以上的材料能够认定为具有较高的抗旱性。

表3 油菜绿肥苗期各指标与综合抗旱指数的关联度和关联序Table 3 Correlation coefficient and order between individual and comprehensive drought-resistance indices (CDI) of Brassica green manure varieties

在获得各指标和综合抗旱指数关联度的基础上，进一步计算出7个指标的权重，并将各指标的权重与其对应的隶属函数值相乘再求和，即可得到各油菜绿肥品种的加权抗旱指数(表4)。加权抗旱指数越高，说明该品种抗旱能力越强。这一结果与表2结果相似。

表4 供试油菜绿肥品种苗期加权抗旱指数Table 4 Weighted drought-tolerance index (WDTI) of tested Brassica green manure seedlings variety

2.3 聚类分析

参试30份油菜绿肥的加权抗旱指数经离差平方和法进行系统聚类分析，得到图1所示聚类图。当欧式距离为5时，参试材料的抗旱性可聚为HR、MR、LR 3个类群，分别表示抗旱能力强、抗旱能力中等和抗旱能力弱。其中，17个油菜绿肥品种聚为HR类，包括甘杂1号(编号13)、陇油8号(编号15)、秦优28号(编号23)、陕油0913号 (编号16)、陕油16号(编号30)、青杂11号(编号17)、合油杂2号(编号11)、荣华油7号(编号1)、天油11号(编号12)和秦杂油4号(编号8)等材料，占总参试油菜绿肥材料的56.7%。聚入MR类的主要有青杂2号(编号14)、青杂 5号 (编号 2)、青杂7号(编号4)、秦优8号(编号7)、沣油737号(编号19)、陕油28号(编号28)、青油12号(编号3)、天油6-14号(编号6)和天油10号(编号21)共8个品种，占总参试材料的26.7%。聚入LR类的主要有陇油14号(编号5)、扬油9号(编号27)、成油1号(编号18)、延油2号(编号 22)和陇油 12号(编号 20)共5个品种，占总参试材料的16.6%。初步筛选和最终利用加权抗旱指数筛选得到的抗旱能力强和抗旱能力差的油菜绿肥品种基本一致。因此，甘杂1号、陇油8号、秦优28号、陕油0913号、陕油16号和青杂11号等17个油菜绿肥品种具有较稳定的抗旱性。

图1 干旱胁迫下30份油菜绿肥苗期加权抗旱指数的聚类分析图Fig. 1 Cluster analysis of the weighted drought-tolerance index (WDTI) of 30 Brassica green manure seedlings varieties under drought stress

2.4 不同抗旱级别油菜绿肥苗期生理指标变化分析

根据上述聚类分析结果，计算并分析抗旱能力强(HR)、抗旱能力中等(MR)和抗旱能力弱(LR)3类油菜绿肥在正常供水（对照）和干旱胁迫条件下其生理指标的变化情况(图2、图3)。整体来看，随着试验的进行，30份参试油菜绿肥的发芽率逐渐增加(图2a)。无论是抗旱能力强还是抗旱能力弱的绿肥品种，干旱胁迫环境下参试油菜绿肥苗期的第1、4和8天的发芽率较对照有提升的趋势，但差异不显著；不同抗旱能力的油菜绿肥品种间发芽率差异显著。试验第1天，HR类17份油菜绿肥材料与MR类和LR类相比具有较高的发芽率，增幅分别为18.6%、185% (P< 0.05)；此外，MR类绿肥材料发芽率较LR类增加140% (P< 0.05)。第4天，HR类油菜绿肥品种平均发芽率为96.5%，与MR类和LR类相比增幅分别为5.5% (P> 0.05)和35.8% (P<0.05)。试验结束时(第8天)，HR类和MR类油菜绿肥品种的平均发芽率无显著差异，却分别较LR类油菜绿肥(84.1%)高出16.5% (P< 0.05)和13.7% (P<0.05)。

图2 第1、4、8天3个耐旱级别油菜绿肥在对照和干旱胁迫条件下的发芽率(a)和第8天3组典型油菜绿肥品种实际发芽情况(b)Fig. 2 Average germination rates (a) of the three drought-resistant Brassica green manure groups under normal water and drought stress conditions on the 1st,4th,and 8th days of germination and germination images (b)of a typical Brassica green manure variety from each group on the 8th day

图3 不同抗旱级别油菜绿肥在对照和干旱胁迫条件下的苗期表现Fig. 3 Seedling performance of different drought-resistant Brassica GM groups under control and drought stress conditions

无论是抗旱能力强还是抗旱能力弱的绿肥品种，干旱胁迫环境下参试油菜绿肥苗期的根长和根芽比较对照均显著增加，增幅分别为39.2%～86.7%(平均52.7%)和86.1%～121.9% (平均96.6%)；而芽长和单株鲜重均显著低于对照处理，降幅分别为16.6%～25.3% (平均21.4%)和31.1%～40% (平均36.6%) (图3)。平均来看，3类油菜绿肥材料苗期除芽长无显著差异外，HR类17份油菜绿肥材料在苗期与MR类和LR类相比具有较高的根长、单株鲜重和根芽比，增幅分别为10.5%～26.5%、11.4%～13.3%和14.5%～21.5% (P< 0.05)；此外，MR类绿肥材料苗期根长较LR类增加14.4% (P< 0.05)。

3 讨论

干旱是制约作物生长发育的主要非生物因素之一，要筛选抗旱性的材料，选择合理的筛选方法至关重要。大田抗旱性鉴定是最直接有效的方法，但存在试验周期长且受环境条件制约性较大、重复性不高的问题。在人工控制或模拟干旱条件研究的各种方法中，聚乙二醇(PEG-6000)渗透胁迫法具有简单易行、条件容易控制、重复性好且试验周期短的特点[14]。PEG溶于水后既能产生强大的渗透压，使植物组织和细胞处于类似于干旱的水分胁迫之中，又因其分子量大，不能穿越细胞膜进入细胞质，不会伤害植物[14-16]。自1979年以PEG作为诱导剂和筛选剂筛选出抗旱的烟草细胞系后，由于其无毒的特点，PEG作为模拟土壤干旱环境的理想渗透剂广泛应用于水稻[17]、小麦[18]、玉米[19]、紫花苜蓿[20]等作物种子萌发以及幼苗阶段抗旱性鉴定研究。符明联等[21]研究表明用PEG- 6000模拟干旱胁迫处理筛选油菜抗(耐)旱材料是可行的，其结果与大田胁迫试验筛选具有较好的一致性。

本试验采用10% PEG-6000模拟干旱胁迫对30份油菜绿肥品种进行了苗期抗旱性研究，结果表明10% PEG-6000干旱胁迫能显著抑制油菜绿肥幼苗的生长，供试油菜的芽长和鲜重等指标较对照均显著下降，而根长和根芽比显著增加，发芽率有提升的趋势但差异不显著，这与其他相关研究的报道[14,22]结果基本一致。涂玉琴等[23]采用10% PEG-6000模拟干旱胁迫的方法，对41份来源于甘蓝型油菜与菜属间杂交获得的稳定高世代品系和32份甘蓝型油菜品种进行苗期干旱胁迫模拟，研究表明PEG模拟干旱胁迫后大部分材料成苗率降低，苗高、苗鲜重和活力指数普遍降低，而根长则明显增加。董小云等[24]采用不同质量分数的PEG-6000溶液模拟水分胁迫，研究发现PEG对4种白菜型冬油菜的成苗率、主根长、苗高、单株鲜质量、相对活力指数均有显著的抑制效应。本研究中，PEG-6000模拟干旱胁迫促进了油菜绿肥种子根系的生长，但对油菜芽长和芽鲜重均没有表现出促进作用，这是因为油菜种子在萌发和生长过程中一旦感受到干旱胁迫，会通过改变其叶片和根系的形态以响应干旱胁迫[25]。油菜叶片作为进行光合和蒸腾作用的重要器官，轻度的水分亏缺会引起其生长显著变慢、叶面积降低，进一步引发植物光合作用减慢、地上部干物质积累降低，最终导致其生长速度减慢甚至停滞[26]。作物根系对抵抗干旱胁迫具有至关重要的作用[25]。在轻度干旱胁迫下，植物根系最先感受到土壤水分的减少，并通过改善根系形态(例如，增加侧根数、深层根数量和根系长度等)来提高根系活力，旨在从周围环境中吸收更多的水分[27]。这不仅是植物适应缺水环境的一种表现，同时也是植物应对干旱胁迫的一种适应性反应。根冠/芽比为根系与地上部生物量(干/鲜)的比值，其数值大小能够反映出植物地下部分与地上部分是否同步变化[28]。干旱胁迫条件下，根系一方面产生信号物质向地上部分运输，另一方面将继续生长以扩大水分的吸收面积；植物地上部通过调节气孔开度以减少水分散失，同时将叶片光合产生的碳水化合物更多向根系分配以保证根系生长，地上部生长则会受到抑制，最终促使作物的根冠比升高[29]。Gao等[30]研究认为，根系的功能制约着作物冠层的发育与资源利用效率，干旱条件下协调作物根冠平衡，最大程度地发挥根系和叶片的功能，才能维持正常生长以及保证产量。

绿肥种子抗旱性是受多种因素影响的复杂数量性状，用单一指标进行抗旱性能评价难以全面反映出植物真实的抗旱能力[31]。因此，采用多指标的综合鉴定评价，其结果更加真实有效。本研究采用隶属函数、灰色关联度分析、综合抗旱指数和系统聚类分析相结合的方法对旱地油菜绿肥苗期抗旱性进行全面评估，结果表明此综合分析方法能够较好地揭示种子萌发特性与抗旱性的相互关系，其中油菜绿肥种子的萌发指数、相对活力指数和根长与综合抗旱指数的关联性更为密切。符明联等[11]研究发现，利用隶属函数法可对干旱胁迫下58份甘蓝型油菜和芥菜型油菜的种间杂交后代的多个性状进行定量综合分析，以消除个别性状指标的片面性，使品种间的抗旱性差异具有可比性。朱宗河等[32]利用主成分分析、隶属函数分析和聚类分析对甘蓝型油菜耐旱性进行分类和综合评价，研究认为可筛选出甘蓝型油菜耐旱种质。谢小玉等[13]将综合抗旱指数和干旱胁迫下的8个指标视为一个整体，利用灰色关联度分析进行油菜抗旱性评价，结果显示灰色关联分析和抗旱性度量值分析有较强的一致性，可以较好地揭示指标性状与抗旱性的关系，同时推荐该方法也可用于其它作物的抗旱性评价。赵阳佳等[33]对油菜、红三叶、田菁、黑麦草、紫云英、毛叶苕子和白三叶7种绿肥作物进行了种子抗旱萌发试验，并利用模糊隶属函数法进行抗旱能力的综合评价，结果表明油菜和黑麦草绿肥种子萌发期的抗旱性强于其他绿肥作物，认为适宜在北京地区推广种植。本研究中参试的30份油菜绿肥品种在外界干旱胁迫时能通过关键生理指标的变化(例如：增加根长和根芽比、促进发芽等方式)来及时响应，建议在后期筛选适宜在黄土高原干旱区种植的其他绿肥品种时应着重关注以上生理指标的变化规律。同时，考虑到室内模拟条件和田间自然环境还存在一定的差异性，后续还需要在田间自然条件下对已筛选出的抗旱能力较强的油菜绿肥品种的抗旱性做进一步综合评价，同时在提升油菜绿肥苗期抗旱能力等方面进行更深入的机理研究。此外，萌发期抗旱性较强的油菜绿肥种子是否在苗期乃至整个生育期也具有较强的抗性？前期抗旱能力较差的油菜绿肥种子在后期生长过程中能否提高抗旱性能？其相关内容还有待进行油菜绿肥苗期和全生育期的进一步研究。

4 结论

油菜绿肥种子萌发指数、相对活力指数和根长与其综合抗旱指数关联较为密切，而鲜重和根芽比与其关联度较弱。总体来看，抗旱能力较强的油菜绿肥在遭遇外界干旱时能通过自身较高的发芽率，增加根系长度，提高根芽比应对干旱胁迫环境带来的不利影响。因此，这3个指标可以用来评价油菜绿肥品种抗旱性的强弱。30个供试绿肥油菜品种中有17个品种因其苗期较强的萌发特性和抗旱能力，适宜在黄土高原旱作区推广种植。