喜树碱衍生物N- 乙酰- Asp- Gly- CPT 的药代动力学研究

姜永红

（东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

喜树碱（Camptothecin，CPT）是一种单萜类的吲哚生物碱，从我国珙桐科植物喜树（Camptotheca acuminata）的提取物中分离获得。喜树碱是拓扑异构酶Ⅰ的抑制剂，具有广谱抗肿瘤活性[1-5]。体内研究显示，喜树碱具有严重的副作用，包括会抑制骨髓的活力、刺激胃肠道引起不适以及延迟性腹泻[6，7]，而且不经修饰的喜树碱存在溶解性差、体内吸收差、活性结构不稳定等问题。为了获取活性更高、毒副作用更小的喜树碱衍生物，研究人员对喜树碱进行结构修饰，已经应用于临床癌症治疗进程的有伊立替康（CPT-11）[8，9]、拓扑替康(Topotecan, TPT)[10]及9- 氨基喜树碱(9-amino- camptothecin,9-AC )[11，12]等。

N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 是本实验室在喜树碱的-20 位羟基引入了甘氨酸和天冬氨酸所合成的喜树碱衍生物（图1），使用甘氨酸酯的空间位阻效应提高了内酯环的稳定性，提高母体喜树碱的溶解性及可吸收性，对于喜树碱的肠道吸收具有积极作用。

图1 喜树碱和N- 乙酰-CPT-Gly-Asp 的结构式

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器仪器

高效液相色谱（美国Waters 公司）；Sorvall Legend Micro 17 型离心机（美国Thermo 公司）；WH-986 静音混合器和WH-861 漩涡混合器（江苏省太仓市科教器材厂）；Luna C18 柱色谱柱（美国phenomenex 公司）。Sorvall Legend Micro 17 型离心机（美国Thermo 公司）；WH-986 静音混合器 和WH-861 漩涡混合器（江苏省太仓市科教器材厂）等。喜树碱（纯度99%），购自哈尔滨峰源高科技开发有限公司。N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 为实验室合成（纯度99%）。SPF级大鼠（300 ± 30 g），购于长春亿斯动物技术有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 血浆样品的采集

精确称取N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 和CPT 各10 mg，分别溶解于10 mL DMSO 中，并用乙腈稀释到400、200、100、80、40、20、10 ng/mL 的工作溶液，置于-40℃冰箱中保存。其中，四个浓度的质量控制样品（QC）分别为 5 ng/mL、10 ng/mL（低浓度）、100 ng/mL（中浓度）和300ng/mL（高浓度）。

给药前，称取适量N- 乙酰-Asp-Gly-CPT，使用注射溶液（DMSO/PEG-400/0.01 mol/L H3PO4= 5/45/50，v/v/v）溶解混匀，获得浓度为2 mg/mL 的N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 悬浊液。

选取3 只健康雄性Wistar 大鼠，体重（300±30）g，使用10%的水合氯醛腹腔麻醉后进行颈脉插管。次日实验前称量大鼠的体重，以3mg/kg 剂量进行尾静脉注射，于给药后0.03、0.08、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 和48 h 取血，将血液置于预先用肝素处理过的离心管中，于4℃、3000 rpm·min-1离心30 min，取上清，并向上清血中加入等体积的0.1M HCl 溶液，混合均匀后置于-80℃冷冻保存。

1.2.2 样品处理

向50 μL 血 浆 样 品 中 依 次 加 入50 μL 0.1M HCl、100μL 乙腈和50μL 内标溶液（CZ44, 100 ng/mL），混合均匀后加入100μL 的1% 乙酸乙腈和500μL 乙酸乙酯，涡旋10 min，13000 rpm/min 离心10 min。取600μL 上清液置于新的离心管内，于氮吹仪中吹干。加入200μL 乙腈复融，室温涡旋10 min，13000 rpm/min 离心，取上清190μL 加入到进样瓶中检测。

1.2.3 标准曲线的制备

按照“1.2.2”样品制备方法制备标准曲线样品，以测得的N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 的峰面积与内标比值为纵坐标（y），N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 的浓度为横坐标（x），使用最小二乘法进行回归运算。

1.2.4 血药浓度测定

根据标准曲线计算各时间点样品的血药浓度，得到药物浓度- 时间曲线。使用药代动力学软件Kinetica 5.0 计算药代动力学参数。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件

使用Waters 高效液相色谱系统（HPLC），1525 梯度泵、2475 型荧光检测器、717 型自动进样器。所用色谱柱为Luna C18 柱。流动相A 为0.1% 的乙酸水，流动相B 为ACN，高效液相色谱系统的流速为1.2 mL·min-1，样品进样体积为30μL，系统的运行时间为25 min。梯度洗脱条件见表1。2475 荧光检测器激发波长为 380nm，发射波长为418 nm。

表1 HPLC 法测定N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 流动相梯度洗脱条件

2.2 标准曲线的制备

求得标准曲线回归方程为y=0.0053x+0.0017，R2=0.9984，浓度范围为10～400ng/mL。

2.3 血药浓度测定

图 2 是大鼠尾静脉给药 3 mg/kg N- 乙酰-Asp-Gly-CPT (2mg/mL) 后，N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 及其主要代谢产物CPT 在血浆中的分布情况，如图所示，尾静脉给药后，血浆样品中可立即检测到N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 和CPT，且给药后，N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 立即达到最大浓度；但在随后迅速下降，在8h 之后基本检测不到。CPT 的血药浓度呈现先上升后下降的趋势，并且浓度明显低于N- 乙酰-Asp-Gly-CPT。

图2 N- 乙酰-Asp-Gly-CPT（左）和CPT（右）的血药浓度- 时间曲线

使用药代动力学软件Kinetica 5.0 计算药代动力学参数，结果见表2。药物在大鼠体内的药动学过程参照非房室模型。尾静脉给药后，N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 的药峰浓度Cmax 是69.75±4.66 ng/mL，约是CPT（2.69±0.54ng/mL）的27 倍；N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 在给药后立即达到峰值，这可能是由于N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 进入体内后迅速代谢，导致采集血液样品时已经达到最大血药浓度。N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 和CPT 的半衰期T1/2 分别为2.93±0.93h 和5.39±0.27 h，平均驻留时间MRT 分别是5.43±1.05 h 和6.95±0.40 h，这说明N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 和CPT 在大鼠血浆中的较为稳定，不会快速代谢；尾静脉给药后N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 的AUC0-24和AUC0-∞分别为 101.77±55.16 h·ng·mL-1和159.87±71.62 h·ng·mL-1，相应CPT 的分别为26.34±15.73 h·ng·mL-1和34.29±23.96 h·ng·mL-1。

表2 大鼠尾静脉给药3mg/kg N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 后N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 和HCPT 的药代动力学参数(n=5)

3 结论

本文建立了一种同时测定大鼠血浆中N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 及其代谢产物CPT 的HPLC 方法，并将这种测定方法应用于Asp-Gly-CPT 在大鼠体内的药代动力学研究分析中。经考察大鼠尾静脉给药后的药代动力学参数，得出N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 进入体内后迅速达到最大血药浓度。N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 和CPT 的T1/2和MRT 均较长，说明N- 乙酰-Asp-Gly-CPT 和CPT 在大鼠血浆中的较为稳定，不会快速代谢。