氯沙坦调节TLR4/NF-κB信号通路对肾血管性高血压大鼠左心室重构的保护作用①

陈强 菅建国 张娟 陈丽珠

（内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院心内科，包头 014010）

在过去十年中，全球死于心血管疾病的人数比以往增加了12.5%，现在因心血管疾病死亡的人数约占全球所有死亡人数的三分之一［1］。高血压相关性左心室肥厚被认为是不良心血管事件的独立危险因素，包括心律失常、心肌梗死、充血性心力衰竭、卒中和肾功能衰竭［2-3］。左心室肥厚不仅是后负荷增加引起的靶器官损害，也是最主要的心血管危险因素。及时治疗和改善左心室肥厚、心力衰竭、缺血性心脏病和房颤能有效提高生存率［4-5］。另外，左心室肥厚还与多种非血流动力学因素有关，包括体重指数、年龄、肾素、醛固酮、血管紧张素、细胞内钙、心房利钠肽、血液黏度、动脉血管顺应性等［6-7］。目前研究显示氯沙坦（losartan，LOS）有减少心室重构和改善心室功能的作用，可以有效改善高血压患者的炎症因子，但是临床疗效及具体的作用机制仍存在争议［8-9］。本研究通过观察氯沙坦对肾血管性高血压大鼠（RVH）心功能、心室重构和心肌纤维化的影响，进一步探讨高血压心脏病的病理机制，同时研究氯沙坦对高血压大鼠心功能、心室重构和炎症因子的干预机制。

1 材料与方法

1.1 材料SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，选取200~250 g、10~12周龄雄性SD大鼠。氯沙坦片（批号：20180902）购自杭州默沙东制药有限公司；小动物彩色多普勒超声诊断仪（富士2100）购自山东帕顿国际贸易有限公司；Masson染色试剂盒购自南京建成生物工程研究所；中性树胶购自国药集团化学试剂有限公司；大鼠CRP、TNF-α、IL-10 ELISA试剂盒购自上海赛默科技生物发展有限公司；大鼠IL-1、IL-6 ELISA试剂盒购自上海纪宁实业有限公司；兔抗TLR4（ab13556 1∶500）和兔抗NF-κB（ab131546 1∶500）抗体均购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；PVDF膜和ECL化学发光剂均购自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 肾血管性高血压模型构建将45只雄性SD大鼠随机分为：空白对照组、模型对照组（RVH）和氯沙坦干预组（RVH+LOS），每组各15只。所有动物实验都严格遵守《实验动物管理条例》。适应性喂养1周后，用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，将大鼠俯卧固定，背部皮肤脱毛后用碘伏棉球消毒，在第三腰椎棘突水平沿背后正中线做1个3~4 cm的切口，切开皮下组织和腰背筋膜，暴露左侧肾动脉。先钝性分离左肾动脉，将0.3 mm的“U”型钛合金夹水平方向套在左肾动脉上，待左肾颜色变为浅红色，取下钛合金夹。同样的方法在较左侧开口高1 cm处做右侧切口，分离结扎方法相同，手术视野内注入0.3 ml青霉素（8×104U/ml）。缝合消毒后肌内注射青霉素4×104U/只，连续用药5 d。Sham组仅游离左、右肾动脉，不做结扎，其余操作均同模型组。每只大鼠用耳标号标记，术前1 d用无创尾部血压计测量血压作为大鼠的基础血压，术后4周测量血压进行评估。每只大鼠选3次血压测量值计算平均血压，3次测量值差距不能超过5 mmHg。大鼠收缩压较术前升高22.6 mmHg（3 kPa）即为造模成功［10］。

1.2.2 干预方案参照文献［11］，造模第2天进行相关药物干预，干预组分别进行氯沙坦5、10、20 mg/kg灌胃给药（1次/d），给药治疗4周，空白对照组和模型对照组给予等量生理盐水灌胃，最后1次给药后禁食24 h，用多普勒超声心动仪评估心功能。

1.2.3 多普勒超声心动图评价大鼠心脏功能多普勒超声心动仪探头型号MS250，检测频率为13~24 MHz。将大鼠麻醉，记录大鼠左室舒张末期内径（LVEDD）、左室收缩末期内径（LVESD）和左心室短轴缩短率（LVFS），辛普森法测定左室射血分数LVEF。

1.2.4 心室/体质量指数测定记录大鼠体质量后将大鼠处死，取出心脏。去除心外膜脂肪组织、大血管、心房和瓣膜等组织，用生理盐水清洗干净并用滤纸吸去多余水分。用电子天平称取并记录心脏重量（HW）、心室重量（VW）和左心室重量（LVW）。用心室重量除以大鼠体质量计算心室/体质量指数。

1.2.5 Masson染色观察大鼠心肌胶原含量胶原容积分数（CVF）心脏组织用4%多聚甲醛固定，经脱水处理后石蜡包埋，做4µm的连续切片，烤片后常规脱蜡至水。根据染色试剂盒说明书，用Weigert铁苏木素染色5~10 min，酸性乙醇分化，再用Massson返蓝液返蓝，随后用丽春红品红染色5 min，经磷钼酸分化后，用苯胺蓝染色1~2 min。分别经过80%乙醇、95%乙醇、2次无水乙醇30 s快速脱水，然后放在二甲苯中透明，取出切片在通风橱晾干后用中性树胶封片。显微镜下观察被染成蓝色的是胶原纤维，心肌组织染成红色，胞核染成黑蓝色。照片用Image pro plus 6.0软件进行分析，心肌胶原容积分数（CVF）为胶原纤维染色面积占切片总面积的百分比。

1.2.6 ELISA测定血清炎症因子用非抗凝注射器从腹主动脉取血4 ml，4℃、2 000 r/min离心10 min后，血清保存在-80℃冰箱，标本收集完全后，在室温下解冻，根据ELISA试剂盒说明书通过ELISA法测定各组大鼠血浆中CRP、TNF-α、IL-6、IL-10的含量。

1.2.7 心肌组织TLR4及NF-κB的表达情况心肌组织在蛋白裂解液中研磨，冰上裂解20 min，4℃、12 000 r/min离心15 min。用BCA试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白加入上样缓冲液金属浴100℃煮5 min使其变性。将蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后转到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭后，置于4℃恒温冰箱分别孵育兔抗TLR4（1∶500）和兔抗NF-κB（1∶500）抗体过夜，第二天孵育HRP标记的山羊抗兔二抗，然后用Bio-Rad凝胶成像系统进行化学发光显影。结果用Image J软件计算灰度值，β-actin为内参，分析TLR4和NF-κB的表达。

1.3 统计学处理数据用Graphpad 7.0进行绘图，SPSS17.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，t检验进行两组间比较，One-way ANOVA进行多组间比较，Western blot条带灰度值用Image J软件分析，数据使用单向方差分析（ANOVA）。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物基本情况实验过程中RVH组大鼠死亡1只，其余两组无死亡。RVH组建模成功，造模后第4周收缩压比造模前升高59.97 mmHg；Sham组造模后第4周收缩压升高10.53 mmHg；RVH+LOS（5、10、20 mg/kg）组造模后第四周收缩压分别升高42.63 mmHg、35.49 mmHg和22.92 mmHg。低浓度LOS（5、10 mg/kg）对肾血管性高血压大鼠的作用低于高浓度LOS（20 mg/kg），因此，后续研究LOS对肾血管性高血压大鼠左心室重构的影响采用20 mg/kg LOS干预组（表1）。

表1 各组大鼠手术前后收缩压比较（±s，mmH）Tab.1 Comparison of systolic blood pressure before and after operation in each group（±s，mmH）

表1 各组大鼠手术前后收缩压比较（±s，mmH）Tab.1 Comparison of systolic blood pressure before and after operation in each group（±s，mmH）

Groups Blank control group（Sham）Model control group（RVH）Intervention group（LOS 5 mg/kg）Intervention group（LOS 10 mg/kg）Intervention group（LOS 20 mg/kg）1 d before operation 113.94±6.74 116.38±4.70 109.42±6.92 115.76±3.29 108.46±7.23 4 weeks after operation 124.47±7.28 176.35±7.32 152.05±7.14 151.25±5.16 131.38±6.19 Mean value of difference（postoperative-preoperative）10.53 59.97 42.63 35.49 22.92

2.2 3组大鼠心脏功能和心室重构指标彩色多普勒超声仪检测心功能指标。结果显示，与Sham组相比，RVH组LVESD和LVEDD水平均显著升高（P<0.05），LVFS、LVEF水平均显著降低（P<0.05）。氯沙坦治疗后与RVH组相比，氯沙坦干预组LVESD和LVEDD水平明显下降（P<0.05），LVFS、LVEF水平明显升高（P<0.05），见表2。与Sham组相比，RVH组心脏重量（HW）、心室重量（VW）、左心室重量（LVW）、左心室/体质量指数均显著增加（P<0.05），而氯沙坦干预后上述指标明显降低（P<0.05），见表3。

表2 氯沙坦对自发性高血压大鼠心功能的影响（±s，n=15）Tab.2 Effect of losartan on cardiac function in spontaneously hypertensive rats（±s，n=15）

表2 氯沙坦对自发性高血压大鼠心功能的影响（±s，n=15）Tab.2 Effect of losartan on cardiac function in spontaneously hypertensive rats（±s，n=15）

Note：Compared with Sham group，1）P<0.05；compared with RVH group，2）P<0.05.

Groups Blank control group（Sham）Model control group（RVH）Intervention group（RVH+LOS）LVESD/mm 58.12±1.53 72.24±0.881）64.54±0.612）LVEDD/mm 30.22±1.02 53.36±0.741）44.18±0.822）LVFS/%46.22±1.10 22.48±0.751）35.64±0.982）EF/%76.98±0.92 43.71±0.751）54.32±0.942）

表3 3组大鼠心室重构指标（±s，n=15）Tab.3 Ventricular remodeling index in three groups of rats（±s，n=15）

表3 3组大鼠心室重构指标（±s，n=15）Tab.3 Ventricular remodeling index in three groups of rats（±s，n=15）

Note：Compared with Sham group，1）P<0.05；compared with RVH group，2）P<0.05.

Groups Blank control group（Sham）Model control group（RVH）Intervention group（RVH+LOS）BW/g 242.31±3.32 238.20±3.54 240.52±4.53 HW/mg 242.32±3.32 1 053.05±14.991）994.53±8.732）VW/mg 441.21±4.89 503.83±11.851）467.04±6.892）LVW/mg 237.23±3.05 293.06±9.261）60.72±4.592）LVW/BW/（mg·g-1）0.98±0.02 1.24±0.131）1.09±0.042）

2.3 3组大鼠心肌胶原含量Masson染色结果用Image pro plus 6.0软件计算胶原纤维染色面积占切片总面积的百分比（心肌胶原容积分数，CVF）。结果显示，与Sham组CVF（5.46±0.68）相比，RVH组心肌胶原纤维明显增多，CVF（14.66±0.45）明显升高（P<0.01）。与RVH组相比，干预组心肌胶原纤维明显减少，CVF（8.18±0.52）明显降低（P<0.01），见图1。

图1 3组大鼠心肌组织的胶原容积分数Fig.1 Collagen volume fraction of myocardial tissue in three groups of rats

2.4 3组大鼠血液炎症因子水平ELISA检测3组大鼠血浆中CRP、IL-6、TNF-α、IL-10的含量。结果如图2所示，与Sham组相比，RVH组血浆中CRP、IL-6、TNF-α的含量显著上升（P<0.05），IL-10含量明显降低（P<0.05）。与RVH组相比，RVH+LOS组血 浆中CRP、IL-6、TNF-α的 含量明 显降低（P<0.05），IL-10含量明显升高（P<0.05）。

图2 3组大鼠血浆中CRP、IL-6、TNF-α、IL-10的含量Fig.2 Levels of CRP，IL-6，TNF-α and IL-10 in plasma of three groups of rats

2.5 3组大鼠心肌组织TLR4及NF-κB的表达情况Western blot检测大鼠心肌组织中TLR4和NFκB的表达情况。结果显示，与Sham组相比，RVH组TLR4表达明显增加，NF-κB表达也明显增加。而与RVH组相比，RVH+LOS组TLR4和NF-κB表达均下降（图3）。

图3 3组大鼠心肌组织中TLR4/NF-κB通路的激活Fig.3 Activation of TLR4/NF-κB pathway in myocardial tissue of three groups of rats

3 讨论

高血压可引起多种心脏有关的疾病，包括高血压心脏病和阻塞性冠心病。高血压性心脏病的定义是高血压患者出现左室肥厚或左室收缩期和舒张期功能障碍及其临床表现，如心律失常和有症状的心力衰竭［12］。在因全身高血压而导致的压力超负荷条件下，左室广泛增长，导致左室肥厚，以维持心输出量。心肌肥厚表现为纤维化、冠脉循环改变和心肌细胞凋亡，可导致心衰、心肌缺血和心律失常［13］。本研究用“两肾两夹”的方法构建大鼠肾血管性高血压模型，诱导大鼠心室重构。彩色多普勒超声心动图结果显示，肾血管性高血压大鼠左室收缩末期直径和左室舒张末期直径都明显增加，左室短轴缩短率和射血分数明显降低。高血压模型组大鼠心脏重量、心室和左心室重量较对照组都有所增加，左心室和体重指数明显升高。结果表明肾血管性高血压模型大鼠心脏结构发生改变并影响心脏功能。

慢性和持续性炎症通路的激活在高血压心脏病引起的心室重构中发挥重要作用。炎症细胞因子可诱导心肌细胞肥大、心肌细胞凋亡和心肌纤维化等心室重构的表型［14］。心肌纤维化是指心肌间质中胶原纤维过度堆积，不同分型胶原比例失调，胶原纤维排列紊乱［15］。心肌胶原容积分数（CVF）是Masson染色后评价心肌间质纤维化程度的指标，高血压模型组大鼠CVF比对照组明显增加。研究表明，左室肥厚的高血压患者同单纯高血压患者相比CRP和TNF-α水平升高。TNF-α是炎症细胞因子，可以诱导心肌肥厚和心肌细胞凋亡。转基因过表达TNF-α的小鼠随年龄增长，心肌细胞肥大同时心肌间质纤维化加重［16］。相反，基因敲除TNF-α的小鼠主动脉缩窄术后心肌细胞肥大减轻和心肌胶原纤维沉积减轻并伴有心肌凋亡细胞减少［17］。IL-6可以降低心肌收缩功能和诱导细胞肥大、胶原沉积和纤维化的发展，体外实验中IL-6可直接引起心肌成纤维细胞胶原合成的增加。在心肌纤维化过程中，IL-6作为促炎细胞因子可以促进心肌纤维化的发生［18］。单核细胞分泌的IL-10作为细胞因子合成抑制因子，抑制心肌纤维化的发展［19］。本研究与文献报道一致，高血压模型组大鼠血浆中炎症因子CRP、TNF-α和IL-6水平明显升高，抑炎因子IL-10水平明显降低。结果提示，炎症反应促进了心室重构的发展。

促炎因子IL-6和抑炎因子IL-10受核转录因子-κB（NF-κB）的调控［20］，因此推测肾血管性高血压导致的心室重构的发生可能与NF-κB通路有关。Toll样受体（TLRs）是存在于哺乳动物细胞表面的细胞跨膜蛋白受体，通过识别相应的高度保守的病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），在抵御外来微生物入侵的先天性免疫应答和触发适应性免疫应答中发挥重要作用，并且通过TLRs信号通路来介导肿瘤的免疫治疗［21-22］。其中TLR4是TLR家族中的最重要一员，TLR4与配体结合后可以激活一系列的信号转导通路，其中包括丝裂原激活的蛋白激酶家族和NF-κB通路，进而上调一系列的炎症因子，激活炎症反应［23］。本研究结果显示，与对照组相比，高血压模型组心肌组织中TLR4和NF-κB蛋白表达均升高，提示TLR4/NF-κB信号通路被激活。

氯沙坦是一种具有抗高血压活性的血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂。它被用于高血压和心脏衰竭的管理［24-25］。目前的研究显示氯沙坦有减少心室重构和改善心室功能的作用，但是临床疗效及具体的作用机制目仍存在争议［26］。本研究观察了氯沙坦对肾血管性高血压大鼠（RVH）心室重构的影响，结果显示，氯沙坦干预组肾血管性高血压大鼠心功能得到了明显改善，心脏结构变化程度和心肌纤维化程度也有所减轻；大鼠血浆中炎症因子CRP、TNF-α和IL-6水平降低，抑炎因子IL-10水平升高；TLR4和NF-κB蛋白表达明显低于高血压模型组。上述结果表明，氯沙坦可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路减轻高血压大鼠的炎症水平，从而改善左心室重构。但是，仍需要进一步证实TLR4/NF-κB通路抑制剂能否阻断氯沙坦对肾血管性高血压大鼠左心室重构的保护作用。

综上所述，氯沙坦调节TLR4/NF-κB信号通路对肾血管性高血压大鼠左心室重构具有保护作用，拓宽了临床对高血压左心室重构作用机制的认识，对防治高血压左心室重构具有重要的理论和实际意义。