苦参碱通过MAPK/mTOR信号通路诱导IMCD3细胞自噬及机制研究①

马广强 牛玲 宋莹莹 万红娇 靳亮

闫成花（江西中医药大学，南昌 330004）

常染色体显性多囊肾病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）是一种常见的单基因遗传性肾病，主要由多囊肾病基因1（Pkd1）和多囊肾病基因2（Pkd2）基因突变所致。发病率为1/1 000~1/400，多见于成人，主要表现为肾小管上皮细胞囊肿，肾实质逐渐纤维化，肾功能进行性减退，最终导致肾功能衰竭以及终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）［1］。据流行病学统计，中国约有150万患者，多囊肾（polycystic kidney disease，PKD）是引起我国终末期肾病的四大病因之一［2］。ADPKD发病率高，预后差，受到社会的普遍关注和医学界的高度重视。患者在临床中常伴有疼痛、血尿以及囊内感染等并发症，患者一生中可能经历数次囊内感染，目前，西医临床对于PKD的治疗无特异性药物，主要通过药物抑制囊肿增大及囊液分泌，以缓解临床症状，延缓肾衰竭，若病情发展至终末期肾病，则以透析治疗或换肾为主，近一半的ADPKD患者最终需要肾脏替代治疗［3］。开发缓解或治疗PKD的有效药物是医学界的一大难题，因此，研究PKD的发病机制，对探寻有效的治疗方案具有重要作用。

中药是我国乃至全球的宝贵财富，诸多中药或者其提取物在各种疾病的治疗上显示了显著的优势。苦参（sophora flavescens ait）为豆科槐属植物，是一种传统中药材，在我国已经有两千多年的使用历史，主要具有清热、利尿、杀虫、祛湿等功效，同时还具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等功能［4］。苦参的生物活性成分主要包括生物碱类和黄酮类成分，其中苦参碱在生物碱中含量相对较大，是最主要的活性物质［5-7］。苦参碱具有抗病毒，抗肿瘤、抗菌以及抗炎等多方面作用［8］。但苦参碱对PKD疾病以及功能机制的研究尚无报道。本研究旨在探究苦参碱对肾上皮细胞自噬的影响及其调节机制，从而为临床治疗PKD患者提供新的治疗思路。

1 材料与方法

1.1 材料高糖培养基（索莱宝，12100）；DMSO（索莱宝，D8371）；优质胎牛血清（GEMINI，900-108）；胰酶（索莱宝，T1350）；IMCD3细胞（上海舜冉生物公司）；无菌PBS（索莱宝，P1020）；显微镜盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司）；苦参碱（湖南凯拉瑞生物科技有限公司，519-02-8）；0.22 μm无菌过滤器（硕华，621110）；BAF（Sigma，B1793）；细胞培养皿（硕华，230101）；细胞培养板（硕华，220100）；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（碧云天，C1062M-1）；CCK-8试剂盒（Bioss，BA00280）；TriQuick Reagent总RNA提取试剂（索莱宝，R1100）；2.5%戊二醛固定液（森倍伽生物科技，BL-G014）；4%多聚甲醛固定液（索莱宝，P1110）；LC3（Proteintech，14600-1-AP）；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（索莱宝，P1200）；5×蛋白上样缓冲液（索莱宝，P1040）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养IMCD3接种于含10%胎牛血清和1%青链霉素的高糖培养基，于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.2.2 CCK-8法检测细胞活性实验将胰酶消化后的IMCD3细胞制成细胞悬液，接种于96孔板中，每孔细胞铺板量为3×104个，置于37℃、CO2培养箱中孵育24 h。分别用0.2、0.4、0.8、1.6 mg/ml的苦参碱处理，每个浓度2个复孔，并设置不加苦参碱的空白对照组，培养24 h后，每孔加入CCK-8溶液20 μl以及180 μl细胞培养液，置于培养箱内孵育40 min。采用酶标仪测定450 nm处的吸光度。

1.2.3 细胞凋亡实验将实验分为：空白对照组；苦参碱处理组（0.2、0.4、0.8、1.6 mg/ml），每样2个复孔。将贴壁细胞IMCD3以1.25×105个/孔，铺板于12孔板中，培养24 h后给药。将对照组和药物处理组的IMCD3细胞使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒染色；将消化后的细胞悬液每样取1×105个细胞，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入195 μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀后加入1 μl碘化丙啶染色液，室温（20~25℃）避光孵育10~20 min，随后置于冰浴中，流式细胞仪检测细胞凋亡并计算细胞凋亡率。

1.2.4 免疫荧光实验将实验分组为：空白对照组；苦参碱处理组（0.8 mg/ml），每样2个复孔。将贴壁细胞IMCD3以2.5×105个/孔铺板于6孔板中，孔内预先放置无菌细胞爬片，加入细胞培养基培养24 h后去掉原培养基，用PBS清洗2遍，按预先实验设计给药培养24 h。在达到上述培养条件后，弃去细胞培养基及苦参碱药液，加入4%多聚甲醛固定液，固定20 min后去掉固定液。0.5% Triton X-100（PBS配制）室温通透20 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；吸水纸吸掉封闭液，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；过夜后加荧光二抗：PBST浸洗爬片3次，每次3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20~37℃孵育1 h，PBST浸洗切片3次，每次3 min；复染核：滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBST洗4次，每次5 min洗去多余的DAPI；用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.2.5 透射电镜样品制备以及观察实验将实验分为：空白对照组；苦参碱处理组（0.4 mg/ml、0.8 mg/ml）。将IMCD3细胞以2.5×105个/孔铺板于6孔板中，加入含有10%FBS的高糖培养基培养24 h后，按实验设计去原培养基给予相应药物继续培养24 h；分别收集对照组和给药组细胞于无酶EP管内，加入2.5%戊二醛固定液，常温固定5 min，5 000 r/min、4℃下离心2 min；去固定液后重新加入2.5%戊二醛固定液，挑起细胞沉淀至其悬浮；室温避光固定30 min，转移至4℃保存。后用锇酸固定，乙醇逐级脱水、渗透，环氧树脂包埋，超薄切片，铀铅染色，在透射电镜下观察并摄片。

1.2.6 Western blot法 检 测LC3、Beclin-1、ERK、p-ERK、AKT、p-AKT、p-p70S6K、p70S6K、p53等蛋白的表达水平将实验分为空白对照组；不同浓度苦参碱处理组。将对数生长期的IMCD3细胞以2.5×105个/孔加入6孔板中培养，24 h后去除原培养基用PBS清洗2遍后，按实验分组设计分别给药培养24 h。每孔加入500 μl配置好的细胞裂解液，用干净的细胞刮刀刮取干净并转移至1.5 ml EP管中，每3 min涡旋振荡15 s，反复5次使细胞充分裂解；振荡完毕后，以12 000 r/min、4℃离心15 min。吸取上清至新的离心管，采用BCA法测量样品蛋白浓度；测出浓度后将蛋白样品稀释至同一浓度，加入总体积1/5的5×上样缓冲液，涡旋混匀后，金属浴100℃加热变性10 min，冷却后于-30℃保存。使用SDS-PAGE试剂盒配置凝胶，将凝胶中的蛋白样品转移至PVDF膜上，5%BSA中室温封闭2 h，加入对应的一抗，4℃过夜，TBST漂洗3次，每次10 min，对应二抗室温孵育2 h，TBST漂洗3次，每次10 min。加入ECL发光液，用Alpha EaseFC凝胶成像系统进行图像的扫描与采集。

1.3 统计学分析用GraphPad Prism 6进行实验数据的统计学分析，两两比较用独立样本的t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 苦参碱对IMCD3细胞活力的影响通过CCK-8检测发现，与空白对照组相比，不同浓度苦参碱（0.2、0.4、0.8 mg/ml）作用细胞24 h后，细胞活力无明显变化，当苦参碱浓度为1.6 mg/ml时，细胞活力受到明显抑制（P<0.05），见图1。

图1 苦参碱对IMCD3细胞活力的影响Fig.1 Effect of matrine on cell viability in IMCD3 cells

2.2 苦参碱对IMCD3细胞凋亡的影响通过流式细胞术检测分析发现，与空白对照组比较，当苦参碱浓度为0.2、0.4、0.8 mg/ml时，细胞凋亡无明显差异，当苦参碱浓度为1.6 mg/ml时，细胞凋亡率显著增加（P<0.05），见图2。

图2 苦参碱对IMCD3细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of matrine on cell apoptosis in IMCD3 cells

2.3 苦参碱对IMCD3细胞自噬的影响通过Western blot检测不同浓度苦参碱对细胞自噬相关蛋白LC3表达的影响，发现随着浓度的增加，LC3蛋白表达明显增强，见图3A。此外，随着处理时间增加，LC3蛋白的表达明显增强，见图3B。以上结果表明，苦参碱对细胞自噬的影响呈浓度和时间依赖性，雷帕霉素是一种经典的自噬诱导剂，将其作为阳性对照。发现雷帕霉素处理组LC3-Ⅱ蛋白表达明显增加，0.8 mg/ml的苦参碱处理LC3-Ⅱ蛋白的表达也明显增加，见图3C。通过免疫荧光染色法检测LC3蛋白的表达，空白对照组中，LC3红色荧光较弱，且呈弥散状态，0.8 mg/ml苦参碱处理组，细胞质中LC3的染色强度明显增强，见图3D。透射电镜分析进一步证实，苦参碱处理后胞浆内自噬小泡的数量明显增多，且呈现浓度梯度依赖性，见图3E。3-methyladenine（3-MA）是自噬的关键调节因子PI3K的抑制剂，可通过阻断自噬早期自噬小泡的形成来抑制自噬。3-MA预处理可降低苦参碱处理组细胞中的LC3-Ⅱ表达，见图3F。说明苦参碱可通过影响自噬小泡形成诱导细胞自噬。

图3 苦参碱诱导IMCD3细胞自噬Fig.3 Matrine induced cell autophagy of IMCD3 cells

2.4 苦参碱影响IMCD3细胞自噬的机制不同浓度苦参碱（0.2、0.4、0.8 mg/ml）处理细胞24 h，随着苦参碱浓度的增加，p-ERK和p-p70S6K的表达明显降低，而Beclin-1、p53、ERK、p-AKT、AKT、p70S6K的表达未见明显变化，见图4。

图4 Western blot检测MAPK/mTOR信号通路蛋白表达Fig.4 Expressions of MAPK/mTOR signal pathway related proteins were tested by Western blot

3 讨论

ADPKD以肾囊肿形成、炎症和纤维化为主要特征。自噬可以清除细胞内损伤的蛋白质，在细胞的生物合成、营养和代谢及应激反应中起重要作用，可以维持细胞正常功能和内环境稳态［9］，影响自噬的信号通路主要包括mTOR依赖的通路（PI3K/AKT/mTOR通路、AMPK/mTOR通路、MAPK/mTOR通路）和非mTOR依赖的通路。自噬与多种疾病的发生密切相关，如肿瘤，代谢失调等。研究发现，自噬与PKD的发生也密切相关，自噬诱导剂可以缓解PKD的发生与发展。有报道PKD动物模型和PKD患者肾上皮细胞自噬反应强度明显减弱，表明自噬与PKD发生密切相关，在PKD发生过程中发挥重要功能［10-12］。肾上皮细胞初级纤毛对PKD具有保护作用，纤毛的存在是激活自噬所必需的，而自噬缺陷反过来又抑制纤毛的形成，从而促进PKD的发生［13-14］。此外，治疗PKD的试剂和药物，如雷帕霉素和mTOR非依赖性药物卡马西平和米诺地尔，主要通过促进肾上皮细胞自噬而发挥功能［15-16］。异常的mTOR激活与PKD中的自噬受损和纤毛缺陷有关［17］。因此，mTOR信号通路介导的细胞自噬可以保护肾功能，延缓PKD疾病的发生发展过程。本次研究发现苦参碱可以通过抑制MAPK/mTOR信号通路中ERK以及mTOR的磷酸化，诱导IMCD3自噬。

研究发现，苦参碱是一种新型自噬诱导剂，在抗肿瘤方面具有重要功能。苦参碱可以通过下调STAT3抑制自噬，抑制线粒体能量的产生，从而抑制KRAS突变型胰腺癌MIAPACA2和8988T细胞的增殖［18］。苦参碱可诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡，但也可通过细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路诱导MG-63细胞保护性自噬［19］。苦参碱在急性髓系白血病中具有重要功能，可以通过抑制AKT、mTOR及其下游底物p70S6K和真核翻译起始因子4 E结合蛋白1（eIF4EBP1）的磷酸化诱导自噬，抑制细胞的增殖，发挥抗肿瘤活性［20］。YANG等［21］2015年发现，苦参碱可以通过增加LC3-Ⅱ，Beclin-1和PI3KC3的表达水平，降低P62的表达水平来诱导肝癌细胞（HCC）自噬。2015年，XIE等［22］发现，苦参碱在不同的人肝癌细胞中诱导自噬的途径不同，激活自噬相关信号通路不同，在SMMC7721细胞主要通过mTOR信号通路诱导细胞自噬，而在HepG2细胞中主要通过p53/AMPK信号通路诱导细胞自噬。苦参碱抑制AKT和mTOR磷酸化，降低p62蛋白表达，促进自噬相关蛋白LC3表达，通过AKT/mTOR途径诱导细胞自噬从而具有抗乳腺癌活性［23］。但苦参碱在PKD中的功能及调控机制却无报道。

本研究聚焦于自噬，主要探究苦参碱对小鼠肾脏内髓集合管上皮细胞自噬的影响及机制。本次研究采用浓度为0.2、0.4、0.8 mg/ml的苦参碱处理IMCD3细胞，发现与空白对照组相比，苦参碱不同浓度处理组IMCD3细胞的活性无变化，细胞的凋亡率也无明显变化，表明苦参碱浓度≤0.8 mg/ml时，不影响细胞的活性和细胞的凋亡。但与空白对照组相比，细胞中LC3蛋白的表达明显升高，且苦参碱浓度梯度依赖性，表明苦参碱诱导细胞自噬，苦参碱浓度增加，对细胞自噬诱导作用越强，这也进一步说明苦参碱可能通过诱导细胞自噬参与PKD的治疗。不同浓度的苦参碱（0.2、0.4、0.8 mg/ml）处理IMCD3细胞24 h后，与空白对照组相比，自噬相关信号通路蛋白ERK以及p70S6K的磷酸化明显降低，苦参碱浓度越高，蛋白磷酸化水平越弱，说明苦参碱能够有效抑制ERK以及p70S6K蛋白的功能，进而促进细胞自噬。

ADPKD的第一大特征囊肿形成，与肾间质炎症和纤维化密切相关，间质炎症可促进肾组织纤维化，可导致囊肿扩张，损伤肾功能［24］。肾间质炎症与囊肿液中多种炎症性细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6等的表达和积累有关，囊液IL-6和TNF-α可诱导肾脏SMYD2表达，SMYD2转录靶基因Ptpn13，通过Ptpn13介导的磷酸化将SMYD2与其他PKD相关的信号通路相连，包括ERK、mTOR和AKT信号通路，促进PKD囊肿生长［25］。巨噬细胞在调节炎症反应中具有重要的功能，在人类PKD和动物模型中发现巨噬细胞浸润与囊肿形成密切相关，巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是ADPKD囊肿生长的重要调节因子，MIF通过激活ERK、mTOR和Rb/E2F通路，促进囊性上皮细胞增殖，促进囊肿形成［26］。苦参碱具有重要的抗炎作用，研究发现在香烟烟雾诱导的气道中性粒细胞炎症模型中，苦参碱通过促进中性粒细胞凋亡，减少气道中性粒细胞炎症［27］；苦参碱还可通过调节CCR7信号通路降低促炎细胞因子IL-1β和IL-17的表达，减轻脂多糖诱导的肠道炎症和氧化应激［28］；苦参碱通过抑制小鼠气道上皮细胞NF-κB信号转导下调SOCS3表达，以剂量依赖性方式显著抑制OVA诱导的小鼠AHR、炎症细胞浸润、杯状细胞分化和黏液生成。体外实验表明，苦参碱可以抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌炎症细胞因子IL-1β和TNF-α［29］。苦参碱能否发挥抑炎功能，通过抑制肾脏炎症，缓解ADPKD的发生发展还有待深入研究。

综上所述，苦参碱主要通过抑制MAPK/mTOR信号通路中ERK以及p70S6K的磷酸化起到促进IMCD3细胞自噬的作用。下一步计划在体内探索苦参碱对PKD的影响，为PKD的新药开发提供理论依据。