烘干玉米和1年陈玉米对产蛋后期蛋种鸡生产性能和肠道微生物的影响

程 雪，刘禹辰，王 忠，宁中华

（中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193）

关键字：蛋种鸡；陈玉米；烘干玉米；生产性能；肠道菌群

玉米作为饲料之王，是家禽能量代谢的主要来源。通过自然风干或机械烘干的方式可以将新鲜玉米中的水分去除后进行储存或饲喂。已有研究表明，饲喂用不同处理方式和储存时间的玉米对家禽生产性能有不同影响。王超等研究表明，与正常玉米组相比，用4年陈化玉米饲喂蛋鸡显著降低了其产蛋率和血清抗氧化能力。穆雅东发现，用4年陈化玉米完全替代正常玉米会显著降低蛋鸡平均日采食量和平均蛋重。

健康的肠道菌群能有效抵抗外来病原体的入侵，保障机体健康。日粮的形态和成分在很大程度上影响着动物肠道菌群的多样性。李锦英等发现，4年陈化玉米饲喂仔猪对其后肠肠道菌群无显著影响。Qamar用4年陈化玉米饲喂肉鸭会改变盲肠菌群多样性，损伤肠道健康。但关于陈玉米对家禽肠道菌群的影响未见报道。目前市场中流通并作为饲粮主要成分的烘干玉米和陈化玉米对蛋种鸡生产性能是否有影响，是否能通过改变蛋鸡肠道菌群结构来调节蛋种鸡生产性能还未知。因此，本试验旨在探索烘干玉米和1年陈玉米对蛋种鸡的生产性能和肠道微生物的影响，为产蛋后期蛋种鸡的健康养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 采用1年陈玉米和烘干玉米品种均为先玉335。1年陈玉米于2018年收割，于仓库中干燥通风条件下存储1年；烘干玉米于2019年收割，烘干风温小于60℃，烘干后进行饲喂。

1.2 试验设计与试验饲粮 选用河北省邯郸市曲周县华耀种鸡场224只健康状况良好、体重接近、生产性能相似的55周龄海兰褐蛋种鸡，随机分为2组（陈玉米组和烘干玉米组），每组7个重复，每个重复16只鸡，4只鸡1个笼子，均匀分布在4层H型鸡笼的第2层。预试期1周，正试期8周。在整个饲喂周期内饲料饮水均不添加任何外源抗生素，参照NRC（2004）和《鸡饲养标准》（NY/T33-2004），并结合《海兰褐蛋鸡饲养管理手册》进行饲养管理。饲料由河北六合饲料厂根据配方制作完成。基础饲粮组成及营养成分见表1。

表1 基础饲粮组成及营养成分

1.3 生产性能测定 试验期间每天按照重复收集鸡蛋，以重复为单位记录产蛋量和蛋重，每日统计试验鸡的死亡情况。每28天结料记录饲料消耗量并计算饲料转化率（料蛋比）。计算55～59、60～63周龄以及55～63周龄期间平均产蛋率、平均蛋重、破蛋率、畸形蛋率。

1.4 肠道微生物 试验结束时，每组7个重复随机各取1只健康状况良好的种鸡。颈部放血处死后无菌操作取回肠近端食糜装入2 mL Axygen离心管中，迅速放入液氮中速冻，尽快转移至-80℃冰箱中存放，全程冷链。根据QIAamp 96 PowerFecal QIAcube HT kit（5）（Cat No.51531）试剂盒说明书提取回肠食糜DNA。所提取DNA被稀释至标准浓度1 ng/μL并存储在-20℃冰箱。利用PCR编码引物343 F（5′-TA CGGRAGGCAGCAG-3′）和798 R（5′-AGGGTATCTAA TCCT-3′）扩增16S rRNA基因的细菌通用V3-V4区。随后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）进一步纯化，使用Quanti Fluor-ST（Promega，USA）试剂盒进行定量。纯化后的扩增子等摩尔量上机并遵循标准规程于Illumina MiSeq平台（上海欧易生物医学公司）进行测序。

1.5 生物信息学分析 由Illumina Miseq测序所得原始数据为FASTQ格式，通过QIIME（version 1.8.0）软件对数据进行处理及后续的生物信息学分析。首先，使用Trimmomatic软件对配对序列进行预处理，检测并去除模糊碱基（N），采用10 bp滑动窗口裁剪法去除平均质量分数小于20的低质量序列。其次，使用FLASH软件对双端序列进行装配（最大Overlap=200 bp、最小Overlap=10 bp、最大错配率=20%）。进一步对模糊序列、同源序列以及长度不足200 bp的序列进行去除。保留Q20值大于75%的序列，去除序列中的嵌合体。使用Vsearch软件对clean reads进行聚类。利用97%的序列相似性进行分类，生成操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTUs）。所有代表性的序列与silva 123数据库进行比对并得到注释信息。

1.6 统计分析 基于OTU的分析进行微生物多样性分析，由QIIME进行。在微生物多样性分析中，计算Chao1、Observe Species、Shannon和Simpson，估算群落丰富度和均匀度，利用Good’s coverage metric进行稀疏度计算，用R vegan package进行物种积累曲线。采用R Vennerable软件包实现Venn图，可视化两组间的OTUs贡献。采用rindval package进行indicator分析，并在各水平上统计各处理组微生物组成。

2 结果

2.1 烘干玉米和1年陈玉米对蛋种鸡生产性能的影响由表2可见，烘干玉米组产蛋率在55～59、60～63周龄以及55～63周龄分别比陈玉米组高6.2%、5.5%以及5.8%（>0.05），且两组其他各项生产性能指标均无显著差异。

表2 烘干玉米和1年陈玉米对蛋种鸡生产性能的影响

2.2 烘干玉米和1年陈玉米对蛋种鸡肠道微生物菌群丰富度和多样性的影响 在提取食靡DNA时，有1个样品质量不合格，故每组只有6个样用于后续测序；在进行非度量多维尺度分析（NMDS）分析时，陈玉米组中有1只种鸡显示离群严重，存在异常，故将其剔除。经过质控和嵌合体去除后，分别获得305 015条clean tags和281 993条valid tags，平均每个回肠样本测得25 635条valid tags用于后续分析。

物种累积曲线和稀释曲线能反映抽样样本量和测序深度是否合理。从图1中可以看出，物种累积曲线随着样本量的增加趋于平缓，说明抽样量合理，能涵盖大多数物种；稀释曲线里每个样本先显著上升后趋于平缓，说明测序深度合理，可以用于后续分析。

图1 物种累积曲线和稀释曲线

在97%的序列相似度下，总共获得878个OTU，其中陈玉米组有671个OTU，烘干玉米组有527个OTU，2组共同OTU有320个（图2）。

图2 OTU韦恩图

Chao 1和Simpson指数可以反映样本微生物的丰富度和均匀度。从图3可以看出，烘干玉米组Chao1和Simpson指数均低于陈玉米组（<0.05）。

图3 Alpha多样性指数小提琴图

为了比较不同处理组各样本微生物群落之间的差异，通过非度量多维尺度分析（NMDS）对其距离进行计算和判断。从图4中可以看出，陈玉米组和烘干玉米组具有明显差异且Anosim<0.05。

图4 NMDS非度量多维尺度分析图

2.3 烘干玉米和1年陈玉米对蛋种鸡肠道微生物菌群结构的影响 从图5和表3中可以看出，厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门是2个组的优势菌门（总丰度占比>95%），但在不同处理组中所占比例不同。与陈玉米组相比，烘干玉米组厚壁菌门由66.56%增加到80.41%（=0.201），变形菌门由14.89%减少到10.95%（=0.201），拟杆菌门和螺旋菌门也有不同程度减少。

表3 门水平微生物丰度统计（丰度>1%）

图5 门水平下丰度top15微生物组成

从图6和表4中可以看出，乳酸杆菌属和是2个组的优势菌属。在陈玉米组中，两菌属分别占总丰度的32.56%和17.75%；在烘干玉米组中，两菌属分别占总丰度的13.11%和49.62%。与陈玉米组相比，烘干玉米组中丰度>1%的菌属远少于陈玉米组。此外，两组中还存在大量其他菌属（分别占总丰度的16.07%和18.20%）。

图6 属水平下丰度top15微生物组成

表4 属水平微生物丰度统计（丰度>1%）

通对各组OTU信息计算Indicator值得出每组的指标性物种。由图7可见，陈玉米组中存在指示性细菌分别为拟杆菌属（OTU_127、OTU_97、OTU_63）、不动杆菌属（OTU_47）、柯林斯氏菌属（OTU_263）、疣微菌属（OTU_123）、菌属（OTU_220）。

图7 Indicator分析图

3 讨 论

3.1 烘干玉米和1年陈玉米对蛋种鸡生产性能的影响本试验中，用1年陈玉米和烘干玉米分别饲喂蛋种鸡，对蛋种鸡的生产性能无显著影响。Mu等发现，4年陈化玉米显著降低了蛋鸡的平均日采食量和蛋重；但常青发现陈玉米对蛋鸡产蛋量、蛋重和料蛋比等指标均无显著影响。研究表明，陈玉米在储存过程中，脂质易发生氧化酸败产生大量游离脂肪酸，同时玉米抗氧化酶活性降低，机体产生更多的自由基，霉菌毒素含量（如黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素等）可能增加，用其饲喂动物易对机体抗氧化能力和生产性能造成负面影响；烘干玉米在机械处理过程中也易使蛋白质变性、脂肪酸升高等，产生粉碎料，影响饲料营养和口感等。两者都可能对动物生长发育有不利影响。但在本试验中，由于陈玉米的储存时间不长，仓库中干燥通风储存，蛋鸡对此可能有一定的调节适应能力，因此对蛋鸡的生产性能影响不显著。

3.2 烘干玉米和1年陈玉米对蛋种鸡肠道微生物菌群丰富度和多样性的影响 家禽肠道菌群在动物营养利用、肠道上皮细胞的营养以及肠道免疫系统的发育和活动中发挥着重要的作用。Chao 1和Simpson指数可以用来衡量菌群的多样性及均匀度。Chao 1和Simpson指数越大，说明肠道菌群多样性及均匀度越高。本试验中，烘干玉米组Chao1和Simpson指数均显著低于陈玉米组，说明烘干玉米组的肠道微生物不如陈玉米组丰富，可能是陈玉米对母鸡自身免疫力、抗氧化状态和肠道形态都有一定负面影响，使得机体肠道中有益菌没直接抑制病原菌或肠道内各菌群间竞争性抑制减少使菌群种类多样。

3.3 烘干玉米和1年陈玉米对蛋种鸡肠道微生物菌群结构的影响 在门水平上，与陈玉米组相比，烘干玉米组中变形菌门和拟杆菌门的相对丰度降低，厚壁菌门相对丰度增加，并在回肠中占有绝对优势地位（80.41%）。厚壁菌门在宿主体内主要参与物质和能量的代谢过程。拟杆菌能促进宿主消化道内碳水化合物和多糖的消化，维持肠道微生态平衡。推测烘干玉米组厚壁菌门的相对丰度增加可能与烘干玉米的能量较陈玉米高有关，从而使其参与了更多的物质和能量代谢。本研究前期同样发现烘干玉米组对饲粮的能量利用率较1年陈玉米组高，其原因也可能是烘干玉米组厚壁菌门提高了对能量的利用和代谢。变形菌门包括许多病原菌（如大肠杆菌、沙门氏菌和幽门螺杆菌等）在肠道中的相对丰度与肠道健康呈负相关。陈玉米在储存过程中，易感染黄曲霉毒素。雷晓娅发现，使用含黄曲霉毒素的玉米饲喂仔猪后，仔猪直肠中大肠杆菌数增多，降低了仔猪生产性能。推测本试验1年陈玉米可能存在霉变导致母鸡回肠里变形菌门含量增加。

在属水平上，与陈玉米组相比，烘干玉米组中乳酸杆菌属所占比例下降，而属含量升高。而李锦英等发现，4年陈化玉米对仔猪盲肠和结肠的乳酸菌和总菌数量影响不显著。这可能与新陈玉米的粗蛋白质含量和机体肠道内挥发性脂肪酸含量有关。随着时间的延长，脂质发生氧化，产生大量游离脂肪酸和挥发性物质（如乙酸和丙酸等）。前期研究发现，陈玉米组对蛋白质的消化利用率低于烘干玉米组，因此由未消化的蛋白质发酵产生的短链脂肪酸也较烘干玉米组多。同时，挥发性脂肪酸对肠道健康有较大的益处。在饲粮中添加0.5 mg/kg丁酸也有利于恢复肠道乳酸杆菌和双歧杆菌的活性。这可能是陈玉米组中乳酸杆菌属和双歧杆菌属较烘干玉米组含量高的原因。关于菌属目前研究较少。据报道，在母鸡日粮中添加黄芪多糖后，蛋鸡粪便中存在较多的乳酸菌和大量减少的，推测这两种菌属之间存在竞争排斥关系。本试验中，与乳酸杆菌属也是存在明显相反的变化趋势，但具体原因有待进一步探究。

4 结 论

本研究结果表明，1年陈玉米和烘干玉米对产蛋后期蛋鸡的生产性能无显著影响；与烘干玉米组相比，1年陈玉米组能显著提高蛋鸡肠道菌群多样性和均匀度，降低菌属丰度，提高乳酸杆菌属丰度。