海军潜艇官兵代谢指标与肠道菌群关联研究

郭妍，满艳茹，刘超乾

随着我海军舰艇编队走向“深蓝”逐渐形成常态化，海军官兵平战时任务增加。潜艇官兵更是由于长时间作业环境特殊，如长期处于狭小和密闭的空间中，活动量少、饮食种类较少、缺乏新鲜蔬果、暴露于高温高湿以及摇摆、有噪音和有害气体、空气流通不畅等不良因素对官兵健康产生一定影响。近期研究发现海勤官兵高尿酸血症、高脂血症等代谢性疾病患病率有增高趋势，高于正常健康人群比例［1-2］。肠道菌群参与机体代谢和能量平衡的调节，包括与糖脂代谢、嘌呤和尿酸代谢相关的能量摄取、利用和消耗，在某些因素致肠道微生态失衡的情况下，对各种代谢性疾病的发生等具有潜在致病作用［3］。深入研究肠道微生物与代谢性疾病的关系，有望使其成为防治高尿酸和高血脂等海军常见代谢性疾病的作用靶点。本研究初步随机抽取某部潜艇官兵（任务时长3个月以上者）和相匹配的健康人群作对比，进行血清生化检测及肠道菌群多样性分析，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

随机抽样选择某部潜艇官兵（任务时长3月以上）共30人作为研究组，均为男性，年龄（28.13 ±6.02）岁，体重指数（BMI）23.84 ± 1.95，并随机选取同期健康体检男性30人作为对照组，年龄（29.03 ±12.26）岁，BMI 23.43 ± 2.99。

1.2 研究方法

1.2.1 血清生化指标的检测 采集2组清晨空腹静脉血，其中研究组在任务结束后第2～3天统一采集血清样本，测定血常规及血生化指标，对指标异常者按发生率进行分组统计。血清样本生化指标通过生化自动分析仪（Hitachi 7600A）进行检测，包括血尿酸（SUA）、肌酐（CR）、尿素氮（BUN）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。

1.2.2 粪便标本的收集 2组均于清晨早餐前采集粪便样本，其中研究组在任务结束后第2～3天统一采集粪便样本，样本装入无菌的塑料管中，并置于-80℃冷冻储存，用E.Z.N.A Bacteria DNA kit提取微生物样本基因组DNA。

1.2.3 肠道菌群基因组提取和测序 根据E.Z.N.A.® soil DNA kit （Omega Bio-tek， Norcross，GA， U.S.）说明书进行微生物群落总DNA抽提，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用NanoDrop 2000测定DNA浓度和纯度；对16S rRNA基因V3～4可变区进行聚合酶链式反应（PCR）扩增（PCR仪，ABI GeneAmp® 9700 型）。将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences， Union City， CA， USA）进行回收产物纯化，通过2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Quantus™ Fluorometer（Promega， USA）对回收产物进行检测定量。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。

1.2.4 肠道细菌微生物多样性数据分析及组间比较 测序结果用美吉云平台分析软件分析，重点比较2组肠道细菌微生物多样性差异、产SCFAs的菌种、前期公认的益生菌的丰度及多样性变化，寻找特殊差异性菌属。将2组比较差异有统计学意义的菌属与血清代谢成份作Pearson相关性分析，发现临床相关性。

1.2.5 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。计数资料以频数和%表示，组间比较采用χ2检验。热点图用R（version 3.3.1）绘制。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 代谢性疾病患病情况

研究组与对照组的代谢指标见表1。其中研究组舒张压低于对照组（P＜0.05），而血尿酸、血红蛋白及TC等代谢指标平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。研究组超重人数为15例，占总人数的50%；肥胖人数为0例；未检出高血压及血糖异常者；高尿酸血症5例，占总人数的16.7%；高TC血症3例，占总人数的10%；高TG血症5例，占总人数的16.7%。与对照组相比，上述代谢异常的患病比例差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 研究组与对照组相关代谢指标比较（±s，每组n=30）

表1 研究组与对照组相关代谢指标比较（±s，每组n=30）

注：TC为血清总胆固醇，TG为血清总三酰甘油，BMI为体重指数；1 mmHg=0.133 kPa

组别对照组研究组P值BMI 23.43 ± 2.99 23.84 ± 1.95 0.527 TG（mmol/L）1.62 ± 1.03 1.40 ± 0.46 0.292收缩压（mmHg）122.03 ± 8.22 118.83 ± 7.56 0.122舒张压（mmHg）72.35 ± 6.23 68.30 ± 5.32 0.006 UA（μmol/L）297.47 ± 76.48 378.07 ± 71.08＜0.001 Hb（g/L）146.70 ± 10.33 154.77 ± 10.80 0.005 TC（mmol/L）4.30 ± 0.84 4.79 ± 0.61 0.012

表2 研究组与对照组官兵代谢相关患病情况比较［例（%）］

2.2 肠道菌群多样性差异

2.2.1 2组粪便肠道菌群Beta多样性分析 Beta多样性分析通过对不同生境或微生物群落间的物种多样性进行组间比较分析，探索不同分组样本间群落组成的相似性或差异性。非度量多维尺度（NMDS）分析是常用的一种。分别分析门水平和种水平的NMDS，基于NMDS的分析的2组样本的聚类图可知组内人群的肠道菌群结构差异明显，但是2组间呈现出高度的聚类现象，且2组分别在门水平（图1A）和属水平（图1B）上均体现了差异性（P＜0.01）。见图1。

图1 研究组与对照组肠道菌群多样性NMDS分析比较

2.2.2 肠道菌群结构分析 2组测序结果绝大部分reads分属下列5个门：拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia），其中厚壁菌门在2组中丰度均为最高（图2A）。进一步细分至门以下水平比较可见2组的菌群分种也有一定差异（图2B）。研究组肠道菌群中的厚壁菌门丰度则明显高于对照组（64.88%vs.53.33%，P＜0.05），拟杆菌门和变形菌门在对照组中的丰度高于研究组（29.87%vs. 10.46%，P＜0.05）。门以下水平中研究组以栖粪杆菌属（Faecalibacterium）（17.78%vs.5.35%，P＜0.05）和普氏栖粪杆菌（Faecalibacterium prausnitzii）所占比重最大（17.61%vs.5.26%，P＜0.05），其次是大肠杆菌志贺菌（Escherichia-Shigella）在研究组中也有优势丰度（8.93%vs.5.21%，P＜0.05）。见表3。

表3 研究组组肠道菌群临床指标与属水平关联分析比较

图2 研究组与对照组肠道菌群门结构和属结构组成比较

表3 研究组与对照组肠道菌群组成差异比较（±s）

表3 研究组与对照组肠道菌群组成差异比较（±s）

菌名厚壁菌门拟杆菌门拟杆菌属栖粪杆菌属普氏栖粪杆菌大肠杆菌志贺菌对照组（n=30）53.33 ± 20.15 29.87 ± 24.65 19.71 ± 20.88 5.35 ± 5.86 5.26 ± 5.80 5.21 ± 11.24研究组（n=30）64.88 ± 15.70 10.46 ± 9.11 7.67 ± 7.88 17.78 ± 11.05 17.61 ± 10.96 8.93 ± 11.13 P值0.034＜0.01 0.015 0.002＜0.01 0.001

2.2.3 临床代谢指标与肠道菌群变化的关联分析 为进一步探索研究组相关临床代谢指标与肠道菌群结构变化关联，通过计算临床因子与所选物种之间的相关性系数（Spearman等级相关系数），将获得的数值矩阵通过热点图直观展示。见图3。可以看出，菌属丰度前3位的菌与大多数指标均有显著关联，拟杆菌属与BMI和TC水平均呈现负相关（r=-0.32和r=-0.33，P＜0.05），栖粪杆菌与舒张压、血尿酸及TC水平呈现正相关（r=0.26，r=0.30和r=0.28，P＜0.05），布劳特氏菌（Blautia）也与BMI及TC水平呈现正相关（r=0.28和r=0.32，P＜0.05）。

图3 研究组肠道菌群临床指标与属水平关联分析热点图

3 讨论

海军官兵代谢紊乱发生情况备受关注，近期针对海勤官兵大规模的研究发现，血液生化指标异常发生率前3位分别为血常规（34.7%）、高尿酸血症（28.7%）、高脂血症（24.2%）［1］，2014-2018年度某部长航船员3 731例次体检报告［2］显示，高尿酸血症457例（12.2%）、高脂血症631例（16.9%），均远远高于正常健康人群比例。同时高尿酸血症和高脂血症短期内增加长航官兵罹患胆道结石、泌尿系统结石、痛风等疾病的风险，这也与近期长远航海勤人员中结石发病率增高是一致的［2,4］，是短期致战斗力和作业能力下降的原因之一。长期效应看，高尿酸和高血脂都是心脑血管疾病的重要危险因素，也是加重慢性肾脏病高危因子，一定程度降低战斗力的同时也增加了部队长期医疗投入负担。国内探讨潜艇官兵代谢性疾病的研究不多，徐帅等［5］分别从2017与2018年在临潼康复疗养中心进行特勤疗养的969名潜艇官兵中随机抽样调查显示，连续2年海军潜艇官兵高胆固醇血症和血尿酸异常的发病率依然高于中国成年男性总发病率。

本研究为初步探索肠道菌群与代谢患病的关联，随机抽取病例数较上述研究都少，重点关注统计了超重肥胖、高血压、高血糖、高尿酸及血脂异常等代谢紊乱，虽然患病率与健康对照者比未见明显统计学差异，但仍可看到血尿酸、血红蛋白及TC等代谢指标水平均高于对照组。

近年来发现，肠道菌群参与机体代谢和能量平衡的调节，以肠道菌群作为切入点来探索相关疾病的发病机制已成为目前国际上的新热点，尤其是代谢性疾病等的发病机制。目前有研究发现，高尿酸血症、高脂血症患者体内存在肠道菌群失调［6-8］。此外，降尿酸、降脂治疗后肠道菌群可发生改变，并且益生菌可能具有降尿酸作用［9］。目前降尿酸的主要药物是黄嘌呤氧化酶抑制剂和促尿酸排泄药，降血脂主要为他汀和贝特类药物，然而这些药物都存在一定不良作用。在我军的医疗卫生服务目前一定程度上存在“重医疗、轻预防”“重体检、轻管理”的现状下，深入研究肠道微生物与代谢性疾病的关系，有望使其成为防治高尿酸和高血脂等部队常见代谢性疾病的新的作用靶点。

潜艇中特殊生活环境因素会影响肠道菌群的代谢产物从而影响肠道菌群的构成和功能变化。吕伟［9］使用高通量测序技术对长远航任务官兵肠道菌群进行测序发现，任务官兵肠道菌群多样性不断降低，致病菌数量多于健康人群，而拟杆菌类有益菌低于健康人群等特点。周典蓉等［10］研究发现长远航作业人员作业前后口腔颊黏膜共生菌群改变；郑巍薇等［11］采集长远航作业人员作业前后脐周微生物样本，经测序分析也发现菌群多样性减小及厚壁菌门相对丰度升高、变形菌门相对丰度降低等结构改变，对长远航作业者的健康状况有一定反映。以上研究均探索了任务人员不同部位微生物生态环境的结构改变，目前尚没有专门针对潜艇官兵肠道菌群与代谢性疾病关联的相关研究。

本研究以随机抽取潜艇人员（任务时长3月以上者）和相匹配的健康人群作对比，肠道菌群多样性分析发现2组肠道菌群分别在不同的细菌结构分类水平均体现了差异性（P＜0.01）。任务官兵肠道菌群中的厚壁菌门丰度则高于对照组，而拟杆菌门和变形菌门的丰度则低于对照组，早在2006年国外就有研究发现与肥胖、胰岛素抵抗等代谢紊乱相关的肠道菌群特征，即厚壁菌门与拟杆菌门的比例升高［12］。本研究中研究组超重、血脂异常等指标较对照组是有一定增高的表现，也符合了菌群的这一改变。另外可以看出，研究组另一富集的栖粪杆菌属及其下属的普氏栖粪杆菌种近年来逐渐被重视，被报道为人体肠道的优势健康菌群，可代谢产生丁酸盐从而促进上皮生长，同时与人体肥胖、糖尿病及宿主的消化道疾病如炎症性疾病、结肠癌等疾病等均有关联。普氏栖粪杆菌已被作为一种潜在益生菌被作为预防或治疗肥胖、糖尿病及肠道疾病的靶点。该研究观察到某部潜艇官兵该类细菌的丰度增加与国家和军队近几年对于海勤人员的关心，包括饮食调整、保健干预措施的加强相关，且各级医疗部门对基层官兵的健康问题愈加重视，经常开展普查体检与健康知识讲座，使官兵的健康意识得到提高，更注重合理膳食。然而目前尚没有明确证据表明任务官兵肠道内丁酸丰度的变化情况，因而这一部分有待于代谢组学的进一步研究。

本研究进一步将潜艇官兵肠道菌群结构特征改变与相关临床代谢指标进行关联分析，发现丰度较大的主要菌群改变与多个临床因子之间是有显著关联的，此次双歧杆菌属（Bifidobacterrium）等明星益生菌虽然未在2组间观察到差异，但其所在的拟杆菌属则检出与BMI和TC水平均呈现负向关联，预示着其中有某种益生菌的成份在起作用，有待后续进一步宏基因组学研究来寻找菌群差异所引起的关键代谢通路的改变，为进一步寻找特殊海战环境下官兵代谢健康干预的靶点提供理论依据，保障官兵健康。