PARP1单核苷酸多态性与转移性食管鳞癌顺铂化疗敏感性及预后关系*

赵 万，仇俊兰，许丽华，张 怀，张 允，余玲玲，奉 林

(南京医科大学附属苏州科技城医院肿瘤科，江苏苏州 215153)

食管癌是第六大常见肿瘤，我国食管癌每年新发病例约占全球的一半[1]。最常见的病理类型是食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)，约占总数的90%。食管癌患者在诊断时多数已处于中晚期，无手术根治机会，化疗仍是最重要的治疗手段。然而，约半数以上食管癌患者对化疗并不敏感，化疗耐药已成为晚期食管癌治疗的瓶颈。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1[Poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1]是一种核蛋白，参与多种细胞功能，包括基因转录调控、染色质重塑及DNA损伤修复[2]。研究发现，在卵巢癌耐药细胞中PARP1呈高表达，通过下调PARP1水平，可恢复癌细胞对顺铂(cisplatin，DDP)的敏感性[3]。此外， PARP1是食管癌细胞中miR-223的直接靶基因，PARP1表达减少的细胞显示对化疗更加敏感[4]。PARP1表达水平还被证实是卵巢癌[5]和食管癌[6]患者的临床预后指标。

PARP1单核苷酸多态性能改变PARP1的转录和表达[7]，进而影响食管癌[8]的发病风险。但是，目前其与肿瘤化疗疗效的关系仍不清楚。因此，本研究旨在评价PARP1基因rs907187C/G、rs8679T/C和rs1136410T/C单核苷酸多态性对接受DDP为基础化疗的转移性ESCC患者的化疗反应及总生存期(overall survival，OS)的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年7月至2020年1月本院收治的175例转移性ESCC患者，其中男97例，女78例，年龄27～79岁，中位年龄58岁，均为汉族。本研究经医院伦理委员会审批(2016KJCYY017)，受试者均自愿参加研究并签署知情同意书。纳入标准：(1)经组织病理学确诊为ESCC；(2)伴有远处脏器或组织转移，无法手术根治切除；(3)至少有1个可经CT扫描测量评价的肿瘤病灶；(4)化疗前心电图、血常规、生化电解质均正常；(5)Karnofsky评分≥70分；(6)预计患者生存期超过3个月。排除标准：(1)年龄<18岁；(2)哺乳期或妊娠期妇女；(3)精神病史或存在认知障碍；(4)属于化疗禁忌证；(5)对研究药物过敏；(6)既往接受过任何形式的抗肿瘤治疗。

1.2 方法

1.2.1化疗方案及疗效评价

所有受试者均接受DDP联合卡培他滨(capecitabine，CAPE)化疗:DDP(齐鲁制药有限公司)75 mg/m2，加入生理盐水500 mL静脉滴注，第1天；CAPE (罗氏制药有限公司)1 000 mg/m2，第1～14天口服，停药7 d，21 d为1个周期。2个周期治疗后行CT扫描测量肿瘤大小变化，依据RECIST1.1实体瘤评价标准，近期疗效分为稳定(SD)、进展(PD)、部分缓解(PR)和完全缓解(CR)。PR、CR属于化疗敏感，而SD、PD对化疗不敏感。所有受试者至少完成2个周期的化疗，在治疗过程的任何时间出现PD，则停止当前方案化疗，更改为二线治疗方案或予最佳支持治疗。

1.2.2随访

本研究使用电话、电子邮件、查阅电子病历系统等方式随访，截止时间为2020年12月30日。本组患者随访3～32个月，Reverse Kaplan-Meier法计算中位随访时间为30.3个月(95%CI：26.56～34.04)。其中19例受试者失访，失访患者的生存时间按截尾数据处理。OS：从首次化疗开始至因任何原因引起死亡的时间(失访患者为最后一次随访时间)。

1.2.3DNA提取和基因型分析

首次化疗前抽取静脉血5 mL，外周血DNA提取采用DNA快速抽提纯化试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，DNA样本置于-20 ℃冰箱保存。使用TaqMan探针法对基因型进行鉴别，PCR引物及探针由上海索宝生物科技有限公司制备，PCR反应预混液(TaqMan Real-Time PCR Master Mixes)由赛默飞世尔科技公司制备，PCR在美国ABI 7900HT实时荧光定量PCR仪上进行。PCR体系：DNA样本1.0 μL，3.0 μL Mix、上下游引物各0.5 μL、TaqMan探针各0.5 μL、双蒸水4.0 μL。PCR循环参数：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共38个循环，72 ℃延伸8 min。捕获荧光信号后，经SDS软件分析得出基因型结果。rs907187：上游引物5′-TCGAATGTGCACTCAGTGATC-3′，下游引物5′-AGTATATGACGCATCGTCTGT-3′，探针：FAM-TACAGTGCTCACGCCATGGACA-MGB，HEX-TACT GCTCTACTAGCTTCGAT-MGB；rs8679：上游引物5′-AGTTAGCTGTCTAATGTGTC-3′，下游引物5′-CTA GTGGAGACTACGACGTC-3′，探针：FAM-TCACGCATCTAGCTAAGTATC-MGB，HEX-TACATCGGCT GATGATCTACAT-MGB；rs1136410：上游引物5′-ATGAGTCGCTTCGACTAGTGTCT-3′，下游引物5′-ATCCTACTCATGCTAACGTACA-3′，探针：FAM-CATGCTACTACATAGATGCTC-MGB，HEX-ATACT GAGTAGCAGTGTTACT-MGB。

1.3 统计学处理

采用SPSS23.0统计软件进行分析。拟合优度卡方检验Hardy-Weinberg平衡。卡方检验分析临床特征与化疗反应的关系；logistic回归分析基因型对化疗反应的影响，计算OR及95%CI，并经性别、年龄、分化等因素调整；Kaplan-Meier法绘制生存曲线；基因型与OS的关系分别用Log-rank检验和Cox回归模型进行单因素和多因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床特征对化疗反应的影响

175例转移性ESCC患者2例(1.1%)CR，66例(37.7%)PR，51例(29.1%)SD，56例(32.0%)PD，总化疗有效率(CR+PR)为38.8%。患者年龄、性别、饮酒史、吸烟史、肿瘤分化程度、食管癌原发部位与化疗反应无关联(P>0.05)，见表1。

表1 175例ESCC患者临床特征与化疗反应的关系[n(%)]

2.2 单核苷酸多态性位点基因型分布

3个单核苷酸多态性位点在175例受试者中均能被明确基因分型。rs907187C/G单核苷酸多态性位点的CC、CG、GG基因型分别为53例(30.3%)、81例(46.3%)和41例(23.4%)，rs8679T/C单核苷酸多态性位点的TT、TC、CC基因型分别为51例(29.1%)、77例(44.0%)和47例(26.8%)，rs1136410T/C单核苷酸多态性位点的TT、TC、CC基因型分别为57例(32.6%)、79例(45.1%)和39例(22.3%)。以上3个单核苷酸多态性位点基因型分布符合群体遗传学Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

2.3 单核苷酸多态性位点基因型与化疗敏感性的关系

rs8679T/C、rs1136410T/C单核苷酸多态性与化疗反应无关(P>0.05)。rs907187C/G单核苷酸多态性与化疗反应明显相关，CC、CG、GG基因型化疗有效率分别为12/53(22.6%)、33/81(40.7%)和23/41(56.1%)，差异有统计学意义(χ2=11.116，P=0.004)。CG杂合基因型化疗反应率为CC基因型的2.337倍(95%CI：1.068～5.113，χ2=4.516，P=0.034)；GG纯合突变基因型化疗反应率为CC基因型的4.326倍 (95%CI：1.771～10.565，χ2=10.334，P=0.001)；CG+GG基因型化疗反应率为CC基因型的2.881倍(95%CI：1.379～6.019，χ2=7.927，P=0.005)。此外， GG基因型化疗反应率明显高于CG+CC基因型(OR=2.514，95%CI：1.229～5.142，χ2=6.375，P=0.012)，见表2。

表2 rs907187C/G、rs8679T/C和rs1136410T/C单核苷酸多态性位点基因型分布及与化疗反应的关系

2.4 单核苷酸多态性位点基因型与患者OS的关系

175例受试者总体中位OS为12.5个月(95%CI：10.912～14.088)。rs8679T/C单核苷酸多态性位点的TT、TC、CC基因型患者中位OS分别为11.6、12.0、14.2个月(χ2=0.955，P=0.620)； rs907187C/G单核苷酸多态性位点的CC、CG、GG基因型患者中位OS分别为10.7、12.8、13.9个月(χ2=0.420，P=0.811)。

rs1136410T/C单核苷酸多态性与患者OS显著相关，随着等位基因C数目的增加，患者中位OS逐步延长，TT、TC、CC基因型分别为9.3、13.2、15.6个月(χ2=11.846，P=0.003)；TC+CC基因型携带者中位OS为13.9个月，较TT明显延长(χ2=7.787，P=0.005)，见图1。

图1 PARP1基因rs1136410多态性位点不同基因型ESCC患者OS曲线对比

使用Cox模型进行多因素分析(纳入年龄、吸烟史、饮酒史、分化程度、肿瘤部位及单核苷酸多态性)，结果显示rs1136410T/C单核苷酸多态性仍是影响ESCC患者OS的独立预后因素(OR=1.717，95%CI：1.208～2.440，χ2=9.088，P=0.003)。

3 讨 论

DDP是治疗晚期ESCC最常用的化疗药物之一，常与紫杉烷或氟尿嘧啶类药物组成联合方案。然而，晚期ESCC对化疗反应存在明显异质性，半数以上患者对化疗耐药，导致预后不良。DDP进入细胞后作用靶点是DNA，可形成铂-DNA加合物，导致DNA链交叉连接，阻断DNA复制和转录、促进凋亡[9]。此外，研究已证实DNA修复能力增强是DDP耐药的主要原因[10]。PARP1是众所周知的DNA修复蛋白，在碱基切除修复通路中发挥重要作用[2]。研究显示，PARP1表达减少使食管癌细胞对化疗的敏感性增强[4]。同时，PARP1表达变化还能影响食管癌患者的生存预后[6]。所以，笔者猜测PARP1基因单核苷酸多态性可能与转移性ESCC患者DDP化疗反应及OS相关。

rs907187C/G单核苷酸多态性位于PARP1基因启动子区，含有E2F1转录因子的结合位点。荧光素酶报告显示，rs907187多态性位点的G等位基因与E2F1结合亲和力低，导致启动子活性下降，并降低神经母细胞瘤细胞株PARP1-mRNA的表达水平 (P=0.003)；基因型组织表达分析也发现G等位基因与较低的PARP1蛋白表达相关(P<0.001)[7]。研究显示，在伊朗人群中，rs907187多态性位点的CC及GG基因型携带者发生乳腺癌的风险显著增高[11]。此前，AVITABLIE等[7]对意大利神经母细胞瘤患者进行研究，发现rs907187多态性位点的G变异等位基因携带者拥有更好的化疗反应(P=0.02)。本研究也发现了类似的结果，随着rs907187多态性位点的G等位基因数目的增加，ESCC患者化疗有效率逐步升高(CC 22.6%、CG 40.7%、GG 56.1%，P=0.004)；CG+GG基因型化疗反应率为CC基因型的2.881倍 (95%CI：1.379～6.019，P=0.005)。根据此前的基因功能学研究[7]，笔者推测rs907187多态性位点变异等位基因G通过影响与E2F1转录因子的结合，下调PARP1的转录、表达水平，减弱了DNA修复能力，使得癌细胞无法修复DDP诱导的DNA损伤，这可能是G等位基因携带者对DDP化疗更加敏感的原因。当然，这种推断仍需更多的单核苷酸多态性功能学研究来证实。

rs8679T/C单核苷酸多态性位于PARP1基因3′-UTR，能影响microRNA与mRNA的结合，进而调控PARP1基因的表达，最终影响结直肠癌的发病风险[12]。然而，最近的研究并未发现该多态性与食管癌发病易感性存在明显关联[8]。此外，ZHAO等[13]对卵巢癌患者进行研究，也未发现rs8679T/C单核苷酸多态性与铂类化疗敏感性相关。同样，本研究也未发现rs8679T/C单核苷酸多态性与ESCC患者化疗反应及OS之间存在关联(P>0.05)。当前，rs8679T/C与肿瘤化疗疗效之间的研究较少，二者间的真实关系尚不清楚，需开展更多的研究深入探讨。

rs1136410T/C单核苷酸多态性属于非同义多态性，碱基T变异为C后导致编码的762位氨基酸残基由缬氨酸(Val)替换为丙氨酸(Ala) ，导致蛋白结构改变，进而影响PARP1蛋白酶的功能[8]。研究显示rs1136410T/C单核苷酸多态性与卵巢癌化疗反应相关， CC基因型患者对铂类化疗敏感，耐药风险显著下降(P=0.001)[13]。另外，在一项食管小细胞癌的研究中，发现rs1136410多态性位点变异基因型TC+CC携带者的中位OS较野生纯合基因型TT患者明显延长，分别为17.4个月和14.8个月(P=0.032)[14]。这与本研究结果一致，本研究首次发现rs1136410T/C单核苷酸多态性与转移性ESCC患者OS相关，变异等位基因C携带者中位OS明显延长(P=0.003)；至少携带一个C等位基因的患者TC+CC中位OS为13.9个月，较TT明显延长(P=0.005)。然而，在接受DDP同步放化疗的宫颈癌患者中，rs1136410多态性位点变异等位基因C与围绝经期和绝经后妇女的OS缩短显著相关(P=0.008)[15]。这与本研究结论并不一致，考虑种族、性别组成、瘤种、肿瘤分期、治疗方案的不同导致研究结果存在差异。

综上所述，本研究发现PARP1单核苷酸多态性能影响转移性ESCC患者的化疗敏感性及生存预后，rs907187多态性位点G等位基因预示更好的化疗反应，而rs1136410多态性位点C等位基因与OS延长相关，本研究结果可能对预测转移性ESCC患者化疗反应及预后有一定的作用。