氯米芬微刺激方案中成熟卵母细胞及可移植胚胎的预测因子分析

朱媛，易善玲，周建军

控制性卵巢刺激（controlled ovarian stimulation，COS）的目的是诱导多个优势卵泡发育，以期获得合适数量的卵母细胞，从而提高妊娠率[1]。常采用的长方案、拮抗剂方案等需给予较大剂量的外源性促性腺激素（gonadotropins，Gn）进行促排卵，可相对提高获卵数及每个促排卵周期的妊娠率，但是使用大剂量Gn促排卵是超生理的，同时增加卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）等并发症的发生风险。微刺激方案因Gn用药量小、更符合卵泡发育的生理状态和治疗时间短等优势被逐渐采用，常用于基础卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）高或基础窦卵泡计数（antral follicle count，AFC）较少的卵巢储备功能下降的患者，但是一些卵巢储备功能正常的患者也可采用微刺激方案，如常规COS卵巢低反应、反复胚胎质量差和一些有特殊情况需先储存胚胎的患者[2]。

2007年国际温和方案辅助生殖技术协会（International Society for Mild Approaches in Assisted Reproduction，ISMAAR）曾提出微刺激方案可作为常规促排卵的替代方案。微刺激方案使用较低剂量Gn获得较少卵母细胞，目的是最大化利用获得的高质量卵母细胞/胚胎。与传统COS方案相比，微刺激方案使用较低剂量Gn可以缩短治疗时间，减轻患者取卵时的疼痛不适，显著降低OHSS发生率，同时单次促排卵费用减少，使患者对体外受精（in vitro fertilization，IVF）治疗的接受度提高。也有研究表明，微刺激方案获得的胚胎质量可能更好，尽管与常规方案相比，微刺激方案每个周期的临床妊娠率较低，但两种卵巢刺激方案的累积妊娠率相当[3]。

目前枸橼酸氯米芬（clomiphene citrate，CC）和来曲唑（letrozole，LE）是微刺激方案中的常用药物，其应用可以减少卵巢低反应患者的Gn用量并降低卵巢储备功能正常患者的OHSS发生率[4]。其中最常用的微刺激方案是单独使用CC或联合人绝经期促性腺激素（human menopausal gonadotropin，HMG）。CC具有较强的抗雌激素作用和弱雌激素活性，可以通过与下丘脑中的雌激素受体结合，抑制内源性雌激素对下丘脑的负反馈，增加内源性Gn的水平，从而促进卵泡发育[5]。同时CC也可以与子宫内膜的雌激素受体结合，影响子宫内膜容受性，降低胚胎着床率[6]。随着胚胎冷冻技术的发展，目前采用氯米芬微刺激方案获得高质量胚胎后通常进行全胚胎冷冻，以避免新鲜周期移植时氯米芬对子宫内膜容受性的影响，因此，是否获得成熟卵母细胞及可移植胚胎是评价该方案是否成功的关键指标。目前关于氯米芬微刺激方案获得成熟卵母细胞及可移植胚胎预测因子的研究较少，本研究旨在探讨患者基本情况、促排卵参数与获得成熟卵母细胞及可移植胚胎的相关性，从而为该方案的促排卵提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象回顾性分析2014年1月—2015年12月在南京大学医学院附属鼓楼医院（我院）生殖医学中心采用氯米芬微刺激方案促排卵行IVF/卵细胞质内单精子注射（intra cytoplasmic sperm injection，ICSI）患者的临床资料。纳入标准：在此期间所有采用氯米芬微刺激方案促排卵、获卵数≥1个且拟全胚胎冷冻的IVF/ICSI患者。排除标准：采用LE促排卵、长方案、拮抗剂方案及其他方案者；未获卵患者。研究共纳入1 029个周期。本研究经我院伦理委员会审核通过（批准编号：2019-052-01），所有患者均签署了知情同意书。

1.2 氯米芬微刺激方案促排卵根据患者的AFC和性激素水平，在月经的第2～4天开始使用CC（塞浦路斯高特制药有限公司）50 mg/d，适时添加HMG 75 U/d（丽珠集团丽珠制药厂）。当优势卵泡直径达到18 mm左右时，肌内注射人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG，丽珠集团丽珠制药厂）5 000 U诱导卵泡成熟。hCG注射后约36 h，经阴道超声引导下取卵。

1.3 IVF/ICSI治疗根据精子的状态及前次IVF受精情况，采用IVF或ICSI受精。将带卵丘放射冠的卵母细胞去除颗粒细胞后于倒置显微镜下观察成熟情况，第一极体排出判定为卵母细胞成熟。受精后（17±1）h评估受精率。优质受精卵母细胞是球形的，2个极体和2个原核并排位于中心。根据欧洲人类生殖与胚胎学学会（European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE）指南对胚胎质量进行评估。在受精后（68±1）h评估第3天（D3）胚胎，将有7～12个卵裂球、碎片率少于15%且非多核受精的胚胎冷冻保存。分别在受精后（116±2）h和（140±2）h评估D5和D6的囊胚。参照人类囊胚的评分系统，根据滋养层细胞（trophoblast cell，TE）、内细胞团（inner cell mass，ICM）等级和发育阶段对囊胚进行评估。当其等级优于4CC时，冷冻保存囊胚，4CC囊胚则不予冷冻保存。本研究中的患者均采用全胚胎冷冻后冻融胚胎移植，不行新鲜胚胎移植。

1.4 统计学方法采用SPSS 21.0软件进行数据分析。定量资料采用Kolmogorov-Smirnov检验对其进行正态性检验，符合正态分布的定量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用两独立样本均数的t检验；不符合正态分布的定量资料采用中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验。定性资料采用例（%）表示，组间比较采用卡方检验。采用多因素Logistic回归分析获得成熟卵母细胞和可移植胚胎的相关预测因子，并计算出每个因子的比值比（odds ratio，OR）和95%可信区间（credibility interval，CI）。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析单个卵泡发育周期hCG注射日血清雌二醇（estradiol，E2）水平预测获得可移植胚胎的价值。所有检验均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氯米芬微刺激方案获得成熟卵母细胞的预测因子本研究共纳入1 029个氯米芬微刺激方案且成功获卵的IVF/ICSI周期，根据是否获得成熟卵母细胞分为获成熟卵母细胞组（916个周期）和未获成熟卵母细胞组（113个周期）。与未获成熟卵母细胞组比较，获成熟卵母细胞组的基础FSH水平低，hCG日最大优势卵泡直径较大，hCG日优势卵泡数较多，hCG日优势卵泡E2水平较高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。而2组患者的年龄、基础黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）水平、基础E2水平、基础催乳素（prolactin，PRL）水平、基础睾酮水平、基础AFC、使用HMG者比例及促排卵时间比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 获成熟卵母细胞组和未获成熟卵母细胞组的基本情况及促排卵参数比较

进一步将P＜0.1的6项因素（年龄、基础FSH水平、基础AFC、hCG日最大优势卵泡直径、hCG日优势卵泡数和hCG日优势卵泡E2水平）采用多因素Logistic回归分析，结果显示hCG日最大优势卵泡直径（OR=1.231，95%CI：1.028～1.474，P=0.024）、hCG日优势卵泡数（OR=2.443，95%CI：1.757～3.397，P＜0.001）、hCG日优势卵泡E2水平（OR=1.000，95%CI：1.000～1.001，P=0.003）是氯米芬微刺激方案获得成熟卵母细胞的独立预测因子，其中hCG日最大优势卵泡直径和hCG日优势卵泡数的OR值大于1，即hCG日最大优势卵泡直径越大、hCG日优势卵泡数越多，获得成熟卵母细胞的可能性越大。而与卵巢储备功能密切相关的指标如年龄、基础FSH水平和AFC均不是氯米氛微刺激方案获得成熟卵母细胞的独立预测因子。见表2。

表2 获得成熟卵母细胞的多因素Logistic回归分析

2.2 氯米芬微刺激方案获得可移植胚胎的预测因子根据是否获得可移植胚胎将1 029个周期分为获可移植胚胎组（622个周期）和未获可移植胚胎组（407个周期）。与未获可移植胚胎组比较，获可移植胚胎组的基础FSH、基础LH水平较低，使用HMG者比例较高，hCG日最大优势卵泡直径较大，hCG日优势卵泡数较多，差异有统计学意义（均P＜0.05）。而2组患者的年龄、配偶年龄、基础PRL水平、基础E2水平、基础PRL水平、基础睾酮水平、基础AFC、促排卵时间和hCG日优势卵泡E2水平比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表3。

表3 获可移植胚胎组和未获可移植胚胎组的基本情况及促排卵参数比较

进一步将P＜0.1的5个因素（基础FSH水平、基础LH水平、使用HMG者比例、hCG日最大优势卵泡直径和hCG日优势卵泡数）进行多因素Logistic回归分析，结果显示hCG日最大优势卵泡直径（OR=1.106，95%CI：1.009～1.213，P=0.031）和hCG日优势卵泡数（OR=1.226，95%CI：1.100～1.366，P＜0.001）是氯米芬微刺激方案获得可移植胚胎的独立预测因子，两者OR值大于1，即hCG日最大优势卵泡直径越大、hCG日优势卵泡数越多，获得可移植胚胎的可能性越大。

2.3 氯米芬微刺激方案中单个卵泡发育周期获得可移植胚胎的预测因子本研究的1 029个周期中有382个周期在hCG日只有1个优势卵泡，将这382个周期根据是否获得可移植胚胎分为获可移植胚胎组（168个周期）和未获可移植胚胎组（214个周期）。与未获可移植胚胎组比较，获可移植胚胎组的hCG日优势卵泡直径较大，hCG日E2水平较高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。2组患者的年龄、配偶年龄、基础FSH水平、基础LH水平、基础E2水平、基础PRL水平、基础睾酮水平、基础AFC、使用HMG者比例和促排卵时间比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表4。

表4 单个卵泡发育周期获可移植胚胎组和未获可移植胚胎组的基本情况及促排卵参数比较

将P＜0.1的3个因素（配偶年龄、hCG日优势卵泡直径和hCG日E2水平）进行多因素Logistic回归分析，结果显示，hCG日E2水平是单个卵泡发育周期获得可移植胚胎的独立预测因子（OR=1.000，95%CI：1.000～1.001，P=0.018）。

进一步采用ROC曲线分析hCG日E2水平对氯米芬微刺激方案中单个卵泡发育周期获得可移植胚胎的预测价值，结果显示，最佳临界值为1 931.25 pmol/L，ROC曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.605，预测获得可移植胚胎的敏感度为74.4%，特异度为46.3%。见图1。根据hCG日E2水平的最佳临界值将这些周期分为2组，高于最佳临界值组的hCG日优势卵泡直径和可移植胚胎率高于低于最佳临界值组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。2组患者的年龄、配偶年龄、基础FSH水平、基础LH水平、基础E2水平、基础PRL水平、基础睾酮水平、基础AFC、使用HMG者比例和促排卵时间比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表5。

表5 单个卵泡发育周期hCG日E2水平高于最佳临界值组和低于最佳临界值组的基本情况及促排卵参数比较

图1 hCG日E2水平对单个卵泡发育周期中获得可移植胚胎的ROC曲线

3 讨论

近年来，由于可以降低OHSS风险，减轻患者在治疗过程中的不适感以及单次IVF的经济负担，氯米芬微刺激方案被逐渐接受[7-8]。研究显示，微刺激方案的胚胎非整倍体发生率显著低于长方案[9]。且采用氯米芬方案和常规方案促排卵后行IVF/ICSI的妊娠率和活产率差异无统计学意义[10-11]。但由于微刺激方案的单个促排卵周期获卵数少，所以获得成熟卵母细胞和可移植胚胎是评价该方案促排卵是否成功的关键指标。因此本研究纳入成功获卵的患者资料，分析氯米芬微刺激方案获得成熟卵母细胞及可移植胚胎的预测因子，以期指导促排卵。

3.1 氯米芬微刺激方案获得成熟卵母细胞的独立预测因子研究显示获卵率与卵泡直径呈正相关[12]，取卵当天，从直径＞18 mm卵泡中获得成熟卵母细胞的可能性比从直径13～15 mm的卵泡中获取高70%[13]。本研究结果与这些前期研究基本一致，即hCG日最大优势卵泡直径大则获得成熟卵母细胞概率高。研究表明随着优势卵泡数增加，获得成熟卵母细胞增多。本研究与以往研究结果基本一致，氯米芬微刺激方案hCG日优势卵泡数与获得成熟卵母细胞的概率呈正相关。本研究氯米芬微刺激方案hCG日优势卵泡E2水平与获得成熟卵母细胞相关。但是hCG日优势卵泡E2水平的OR值只有1.000，所以促排卵过程中并不是卵泡越大、E2水平越高越好，需综合考虑选择合适的扳机时机。

3.2 氯米芬微刺激方案获得可移植胚胎的独立预测因子既往研究表明，从直径＞18 mm的卵泡中获得卵母细胞形成的胚胎评分更高，且优势卵泡数越多获得可移植胚胎的概率越大。本研究发现hCG日最大优势卵泡直径和优势卵泡数是氯米芬微刺激方案中获得可移植胚胎的独立预测因子，这与以往的研究结果一致，提示在合适情况下优势卵泡大、增加获卵数可以提高获得可移植胚胎的概率。本研究显示，与卵巢储备功能密切相关的指标如年龄、基础FSH水平和基础AFC均不是获得成熟卵母细胞及可移植胚胎的独立预测因子，这可能与本研究的人群选择偏倚有关，本研究排除了未获卵的患者。

3.3 氯米芬微刺激方案中单个卵泡发育周期获得可移植胚胎的独立预测因子有研究显示，血清/卵泡E2水平的提高与卵母细胞和胚胎质量的提高呈正相关[14-15]。既往研究也发现，在较少卵泡发育的IVF周期中可以通过血清类固醇水平来监测卵母细胞的成熟和胚胎发育[16]。本研究进一步分析单个卵泡发育周期获得可移植胚胎的预测因子发现，hCG日E2水平是评估卵泡成熟度的较佳临床指标。通过ROC曲线分析单个卵泡发育周期获得可移植胚胎的hCG日E2水平最佳临界值后发现，高于最佳临界值组的可移植胚胎率显著高于低于最佳临界值组。因此在单个卵泡发育周期中通过监测E2水平在合适时机扳机可获得较好结局。

3.4 本研究的局限性本研究属于回顾性研究，需要通过前瞻性研究进一步证实这些结果的临床应用有效性。本研究没有对采用微刺激方案促排卵的原因进一步分层分析，因为反复胚胎质量差的患者获得可移植胚胎的概率可能较其他原因患者低。本研究均纳入全胚胎冷冻患者，有一些患者经历多次取卵后行冻融胚胎移植，所以无法评价这些周期参数的妊娠结局。

综上所述，采用氯米芬微刺激方案，在合适的情况下，优势卵泡数及单个卵泡发育时hCG日E2水平可用于预测获得可移植胚胎的概率，但仍需进一步大样本前瞻性研究证实。