内质网应激在丙肝病毒感染发病学中作用的研究进展

李明皓，范亮亮，项 荣

(中南大学 湘雅医学院，湖南 长沙 410013)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)属黄病毒科的包膜阳性RNA病毒[1]，其遗传物质9 500～10 000 bp，通常不整合到宿主基因组，能编码长为3 014个氨基酸的蛋白前体，后者经过蛋白质水解产生核心蛋白、包膜蛋白E1、E2及非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B(表1)[2]。全世界约有3%的人感染HCV，HCV感染可发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌[3]，已成为重大的公共卫生问题之一。肝细胞内HCV基因组表达导致大量病毒蛋白和RNA复制中间产物在内质网中积累，从而触发内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，为缓解ERS， 细胞将激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)以消除感染促进细胞回归稳态；但UPR也可被病毒操纵，深化感染并减弱抗病毒反应[4]。当ERS太剧烈难以通过UPR缓解时，细胞将激活凋亡通路。在HCV感染的过程中，ERS介导的UPR可使肝细胞核因子4α和其下游的具有抑癌作用的miR-122表达水平均被调低，从而导致肿瘤的发生，这也是HCV感染发展为肝细胞癌的原因[5]。因此，探明病毒感染与宿主细胞内质网应激的作用机制对丙型肝炎病毒感染的治疗意义重大。

表1 HCV相关蛋白功能Table 1 Functions of HCV related proteins

1 HCV感染与ERS和UPR

1.1 ERS介导的UPR反应及其相关通路

为缓解ERS的有害影响，细胞会激活UPR通路。在人体细胞中，UPR一般由3个分子介导：PERK(蛋白激酶R受体样内质网激酶)、IRE1(需肌醇酶1)和ATF6(激活转录因子6)。这3个分子一般与GRP78(内质网驻留伴侣分子葡萄糖调节蛋白78)结合；当错误折叠的蛋白在内质网积累时，3个分子与GRP78分离，激活下游相关通路[6]，分述如下。

当细胞发生ERS时，PERK被激活，并使eIF2(真核细胞翻译起始因子2)的亚单位eIF2a磷酸化。活化的eIF2a可诱导翻译抑制并增加ATF4(激活转录因子4)表达，ATF4可以激活GADD34(增殖停滞和DNA损伤诱导蛋白34)的表达，从而招募PP1使eIF2a去磷酸化并削弱其介导的翻译抑制，形成负反馈调节[7]。ATF6是一种BZip转录因子，作为跨膜蛋白，当ERS发生时，其移入高尔基复合体并激活。活化ATF6可入核，激活内质网蛋白折叠相关基因表达：如ER伴侣、蛋白二硫化物异构酶等。IRE1-XBP1通路起始于IRE1的激活，活化的IRE1从XBP1(X盒结合蛋白1)mRNA中剪除26个核苷酸的内含子[8]，剪切后的XBP1被翻译后作为转录因子，增强相关基因表达，促进ER相关蛋白降解(ER associated protein degrada-tion，ERAD)。剪切后的XBP1还能够激活p58ipk，而p58ipk可削弱PERK磷酸化eIF2a的能力[9]。IRE1的亚基IRE1B还可通过其RNA酶活性参与IRE1依赖性衰变(regulated IRE1 dependent decay，RIDD)途径，降解ER结合的mRNA，减少蛋白质翻译并限制内质网腔中未折叠的蛋白质负荷，调节ERS[10]。

1.2 HCV感染与ERS介导的UPR

在晚期丙型肝炎患者和病毒性肝硬化患者中，HCV的非结构蛋白NS4B对UPR通路的激活作用是目前已知最强的，其可使ATF6从内质网转移到高尔基复合体，可激活ATF6；还可激活XBP1的剪切从而触发UPR[11]。此外，尚有研究表明NS4b还可以通过诱导IRE1的磷酸化从而诱导UPR的发生[12]。在酵母模型中的研究还表明，HCV未成熟的核心蛋白可通过ERAD诱发UPR[13]。当包膜蛋白E1和E2积聚在ER中时，GRP78与其相互作用。从E1和E2中去除信号肽，可将这些蛋白质定向表达到细胞质，这些细胞质靶向的E1/E2可通过诱导XBP1的合成和剪切诱导UPR[14]，此外，E1还可以通过抑制PERK对UPR起到抑制作用[15]。目前关于HCV其他蛋白组分激活UPR的机制尚不明确，通过已发现的UPR激活途径，可知病毒蛋白通过对UPR通路中各感知蛋白的活性调节，对UPR进程进行调节，在病毒减弱细胞抗病毒反应的同时，使感染细胞维持一定程度的稳态，以深化感染，增强侵袭力。

PERK-eIF2a途径能降低胞内蛋白质合成的整体水平，但HCV仍能翻译mRNA，因为HCV能自行招募和组装起始核糖体复合物，并通过激活eIF2a并磷酸化PP1，诱导其调节亚单位GADD34来抑制eIF2a活化；上调其抑制剂p58ipk的转录来抑制PERK的活性，其包膜蛋白E2甚至可作为PERK的伪底物来隔离其活性。

HCV亚基因组复制子可通过抑制剪切后XBP1的合成来抑制IRE1-XBP1途径，这可能有助于增强病毒蛋白的合成和持续感染。

2 HCV感染与ERS相关细胞凋亡

2.1 ERS相关细胞凋亡通路

ERS剧烈，在难以通过UPR缓解时，细胞便激活凋亡通路。PERK-eIF2a-ATF4通过激活C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)，上调BH3-only蛋白表达和下调抗凋亡蛋白发挥促凋亡作用。此外，CHOP可激活死亡受体5、Tribbles相关蛋白3、GADD34和内质网氧化酶1a触发凋亡，其中，GADD34和内质网氧化酶1a通过影响活性氧物簇的积累调节凋亡。激活的PERK通过增强含有抗氧化反应元件基因表达来保护细胞。IRE1也可通过IRE1-TRAF2-JNK通路促进凋亡。活性IRE1与肿瘤坏死因子受体相关因子-2相互作用，然后磷酸化JNK(Jun氨基末端激酶)[16]，连接JNK与凋亡的介质是Bcl-2家族：抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1)，促凋亡蛋白(Bax、Bak)和促凋亡的BH3-only蛋白(Bad、Bim、Bid、Noxa、Puma)[17]。BH3-only蛋白对于抗凋亡蛋白介导的Ca2+释放是必要的，释放的Ca2+可被线粒体吸收，导致细胞色素C外流，引起细胞凋亡。JNK磷酸化抗凋亡蛋白以降低其活性，磷酸化BH3-only蛋白质以增强其活性[18]。此外，RIDD的持久激活可能通过降解基本蛋白的mRNA而引起凋亡[10](图1)。

2.2 HCV蛋白对凋亡通路的调节

HCV的不同蛋白组分可通过与凋亡通路之中的相关感知蛋白结合，进而调节病毒感染和细胞存活或凋亡之间的平衡，为病毒进行持续感染创造条件(图1)。

A.HCV中不同种类蛋白对UPR通路的调节; B.HCV中不同蛋白对凋亡通路的调节[27]图1 HCV中不同种类蛋白对相关通路的调节Fig 1 Regulation of correlated pathways by different protiens in HCV

2.2.1 HCV核心蛋白与凋亡：核心蛋白构成的核衣壳可激活与各种细胞信号通路有关的不同的启动子，发挥不同的调节作用，核心蛋白通过阻止线粒体释放细胞色素C并抑制caspase-9、caspase-3、caspase-7的级联激活来抗凋亡；也可与p53结合，发挥抗凋亡作用[19]；核心蛋白还可通过磷酸化激活STAT3来抑制肝癌细胞凋亡[20]。核心蛋白也可间接激活Bax来诱导凋亡。

2.2.2 包膜蛋白E1和E2与凋亡：E1和E2是包膜蛋白，能介导病毒结合进入细胞[21]。在表达HCV蛋白的转基因小鼠模型中，CD95配体介导的肝细胞凋亡分别受到E1和E2的抑制，细胞色素C释放和caspase-9激活也受E2抑制；在表达E1的肝细胞中，E1的C端跨膜域可能使膜通透性得以改变，从而导致凋亡。

2.2.3 非结构蛋白与凋亡：非结构蛋白NS2和NS3是蛋白裂解所需的两种蛋白酶[22]。NS2是一种跨膜蛋白，定位于ER内，其在肝细胞凋亡和病毒性肝炎中的作用仍不明确。

NS3具有螺旋酶和三磷酸酶活性，通过抑制ROS累积与特异性分解下游Cardif蛋白可阻止病毒RNA诱导的RIG-I促凋亡效应。此外，NS3在肝细胞和树突状细胞中诱导caspase-8依赖性凋亡[23]。

NS4a是一种与NS3结合的辅因子，可单独存在或与NS3复合存在，通过诱导细胞色素C释放和caspase-3激活凋亡[24]。NS4b是一种完整的ER膜蛋白，在锚定复制复合体中起到作用，在其凋亡信号通路中的作用尚未明确。

NS5a可干扰对干扰素的反应，在病毒复制中起重要作用。NS5a与Bcl-2序列同源，与FKBP38结合，可增强Bcl-2家族的抗凋亡作用[25]，抑制Bax在肝癌细胞中的促凋亡作用[26]。NS5a的抗凋亡作用还可通过p53的细胞质隔离过程等介导[26]。NS5b是病毒RNA依赖性RNA聚合酶，暂时还没有NS5b在肝细胞凋亡中的研究。

3 问题与展望

ERS可作为HCV病毒感染过程中的检测指标。ERS相关基因的表达与病毒性肝炎发病机制密切相关，在病毒诱导的细胞凋亡和炎性反应中起重要作用，但目前对HCV中的一些蛋白(如NS2等)具体调控ERS相关通路的分子机制尚不明确，有待进一步研究。因此，未来可通过体内外实验，寻找更多与HCV感染和与病毒性肝炎发病相关的ERS靶基因并深入研究HCV中蛋白组分激活ERS的相关机制，从而探讨发掘出相应的基因治疗方法或靶点的可能性，以获得更有效、更有针对性的预防和治疗病毒性肝炎的药物和方法，减少甚至逆转病毒感染对人体细胞带来的损害。