上海青中9种抗生素的超高效液相色谱-串联质谱测定

刘宏伟，杨名平，江锋，苏国成，周常义

(1.集美大学海洋食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.厦门中集信检测技术有限公司，福建 厦门 361100)

0 引言

目前，全球抗生素年使用量超过10万t，这日益增加了人们对农业生态系统污染问题的担忧[1-2]。中国是世界上最大的抗生素生产国和消费国，随着抗生素在畜牧业生产中的广泛应用，含有抗生素的禽畜粪便通常被作为肥料施用于土壤中[3]，大量抗生素通过排泄的方式进入到环境基质中，继而也可能从土壤转移到作物，对人类的身体健康构成潜在危害[4-5]。最终，抗生素通过动物粪便被引入土壤[6-7]，导致土壤中抗生素残留日益增加。因此，畜牧业抗生素的广泛使用是导致农业环境污染的主要因素之一[8]。

Pan等[9]在我国黄淮海平原4个省(市)收集了105个土壤样品，包括13组土壤剖面样品和23对温室及露地表层土壤样品，检出的抗生素有四环素类、喹诺酮类、磺胺类和大环内酯类，抗生素总质量比为1.62～575 mg/kg。Zhang等[10]为研究长期施用有机肥导致的抗生素污染，对我国东部、西部地区125个表层土壤进行了多种抗生素的采样分析，结果表明，农用地抗生素浓度的累积量显著高于常规露地。Zhang等[11]采集中国8个省份的50份粪便和堆肥样品，检测发现，在鸡粪样本中四环素质量比高达417 mg/kg。有人报道了动物粪便中普遍存在的氟喹诺酮类残留[12-15]。潘霞等[16]剖析了在种植水果蔬菜的土壤中使用畜禽粪便制成的有机肥料后，发现不同作物的表层土壤中蓄积的氯霉素类含量占比不同，最高可达30.3%。

抗生素通过畜禽粪便施肥及废水灌溉农田进入土壤后，会在土壤与植物之间发生迁移转化。研究发现，使用含有畜禽粪便废水灌溉的农田土壤中生长的植物，其组织内可以检测到一定量的抗生素。Dolliver等[17]在粪肥改良土壤生长的玉米、生菜和马铃薯中检测到了μg/kg～mg/kg(干重)水平的磺胺二甲嘧啶。Kang等[18]检测了粪肥改良的土壤中生长的11种蔬菜中的5种抗生素，其中磺胺二甲嘧啶、金霉素、泰乐菌素等抗生素在植物组织中的浓度都在μg/kg水平。Hu等[19]研究了使用畜禽粪便施肥过的田地，发现油菜、香菜、胡萝卜、芹菜等对11种抗生素有吸收积累的情况，在蔬菜中检出浓度较高的抗生素是土霉素和四环素，分别为76.8和79.3 μg/kg。

我国已经制定了肉类食品中抗生素最大残留限量标准及其检测方法[20]，但对于蔬菜中抗生素含量尚未出台相关检测标准。因此，本研究选取9种常用的抗生素，研究多种抗生素在上海青中残留同时测定的检测方法，为抗生素多残留的定量分析和安全风险评估提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂

乙腈，色谱纯/分析纯，德国默克试剂公司；氯化钠、无水硫酸钠，分析纯，西陇科学股份有限公司；甲醇、乙酸乙酯、冰乙酸，分析纯，德国默克试剂公司；甲酸，色谱纯，德国默克试剂公司；氧氟沙星(>99%)、达氟沙星(>99%)、洛美沙星(>99%)、培氟沙星(>99%)、环丙沙星(>99%)、恩诺沙星(>99%)、氯霉素(>97%)、甲砜霉素(>97%)、氟苯尼考(>97%)均购自赛飞尔公司；氯霉素-D5 标准品(100 mg/L，1 mL)，农业部农产品质量标准研究中心。

1.1.2 主要仪器

UItiMate 3000型超高效液相色谱仪，TSQ Endura型三重四极杆质谱仪，均为赛默飞世尔科技有限公司。

1.1.3 样品来源

上海青购自厦门市同安区蔬菜市场。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

准确称量上海青2 g(精确至0.1 g)，置于干净的50 mL具盖离心管中，加10 ml乙腈溶液、5.0 g无水Na2SO4、3 g NaCl进行盐析，涡旋1 min，超声提取10 min后，8 000 r/min离心3 min，充分分离。取上清液置于另一干净的50 mL具盖离心管中。离心后的残渣再加入10 mL乙腈提取溶液。重复上述步骤，合并提取液，加入0.1 g C18、0.1 g PSA粉末，涡旋1 min，5 000 r/min离心3 min，将上清液全部转移到50 mL空白具盖离心管中，40 ℃加热氮吹至近干，用1.0 mL 质量分数为0.1%的甲酸-乙腈溶液复溶，过0.22 μm有机滤膜，供UPLC-MS/MS检测。

1.2.2 液相色谱-串联质谱条件

1.2.2.1 液相色谱条件

正离子模式。流动相：C为质量分数0.1%甲酸的超纯水，D为乙腈。梯度洗脱程序：0～1 min，D质量分数为5%；1～11 min，D质量分数为5%～84%；11～11.5 min，D质量分数为84%～95%；11.5～12.5 min，D质量分数为95%；12.5～13 min，D质量分数为95%～5%；13～16 min，D质量分数为5%。

负离子模式。流动相：A为超纯水，D为乙腈。梯度洗脱程序：0～0.5 min，D质量分数为20%；0.5～3.5 min，D质量分数为20%～95%；3.5～4.3 min，D质量分数为95%；4.3～4.5 min，D质量分数为95%～20%；4.5～7.0 min，D质量分数为20%。

1.2.2.2 质谱条件

离子源为电喷雾电离ESI+和电喷雾电离ESI-；喷雾电压为3.5 kV(ESI+)和3.2 kV(ESI-)；鞘气压为35 Arb(ESI+)和30 Arb(ESI-)；辅助气压为15 Arb(ESI+)和10 Arb(ESI-)；离子传输管温度为320 ℃(ESI+)和300 ℃(ESI-)；喷雾温度为300 ℃(ESI+)和250 ℃(ESI-)。

2 实验结果与分析

2.1 质谱条件优化

色谱仪的优势在于能够较为准确地从混合物中分离出目标化合物，但是物质的具体结构信息却很难得到，所以质谱仪主要依靠样品与标准物的对比来对未知物质进行分析。因此，在进行质谱分析之前，质谱仪要先建立标准物质的数据库，才能高效、高选择性、高灵敏度地进行分析。常见的质谱仪主要有磁偏转式质谱、四极杆质谱(Q-MS)、离子阱质谱(IT-MS)、飞行时间质谱(TOF-MS)和傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)5种类型。本文使用赛默飞世尔公司 UltiMate 3000 超高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱仪进行分析。

为获得最佳灵敏度和分离效果，对12种单标溶液依次采取蠕动泵注射的方式进行一级质谱扫描，扫描结果如图 1～图2 所示。

由图1～图2可见，在正离子模式下，喹诺酮类抗生素形成稳定的峰，氯霉素类抗生素在负离子模式下形成响应强且稳定的峰。依次优化碰撞电压和射频透镜电压，选取丰度较高的母离子、子离子，最终确定定性定量离子和碰撞电压的质谱数据(见表1)。

表1 9种抗生素及抗生素内标的 UPLC-MS/MS 分析优化参数

2.2 提取条件优化

参照文献[21]喹诺酮的提取方法和文献[22]多种抗生素的提取方法，由于9种目标抗生素的理化性质差异较大，本研究在优化提取溶液时，使用加标样品比较了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、冰乙酸4种不同的提取溶剂，结果表明，乙腈溶液在同时提取氯霉素类和氟喹诺酮类抗生素时的回收率最高，结果如图3～图4所示。

2.3 净化方法优化

样品经过萃提过程,实际上已经初步去除部分干扰物质，但仍需净化处理。蔬菜中的农药兽药残留检测常用的净化方法包括固相萃取法和QuEChERS法，本文QuEChERS法使用PSA和C18 2种材料作为吸附剂，固相萃取法选择固相萃取柱HLB(60 mg，3 mL)。C18材料具有疏水性特点，其有效组分为十八烷基的硅胶键合物，对去除提取液中脂肪和非极性成分具有良好的效果[23]。PSA材料有效组分为极性官能团的硅胶键合物，能与弱阴离子交换,也可吸附极性物质，对色素、有机酸和金属离子含量较高的样品有很好的净化效果[24]。Oasis HLB是一种反相固相萃取柱，它能很好地保留酸性、碱性和两性化合物；填料是一种多孔共聚物，其成分是亲水性N-乙烯基吡咯烷酮和亲脂性二乙烯苯，因此对目标化合物的富集效果要优于其他固相萃取柱[25]。

本文以上海青为基质，比较了固相萃取法和QuEChERS法对9种化合物的净化情况，结果见图5～图6。结果表明，相比于QuEChERS法固相萃取法，培氟沙星、甲砜霉素的回收率略低。原因是加入样液后，与水或乙腈这些极性较大的溶剂同时存在，柱压升高，柱体堵塞，回收率降低。

2.4 方法学验证

2.4.1 基质效应

基质效应是液相色谱-串联质谱定量分析中产生误差的重要来源，任何一种物质的检测都无法避免基质效应产生的干扰现象[26]。按照优化的实验方法，以空白基质样液与纯溶剂中抗生素峰面积的比值评价基质效应[27-31]，计算公式为：基质效应/%=Am/As×100。其中：Am为基质样液中抗生素峰面积；As为纯溶剂中抗生素峰面积。比值越接近100%，基质对检测分析影响越小；比值大于100%，基质对检测分析有增强效应；比值小于100%，基质对检测分析有抑制效应[32]。

按照节1.2的方法对空白样品进行前处理，然后配制空白基质标准溶液和纯溶剂标准溶液，测定基质效应。结果表明，对上海青中抗生素检测分析发现，除培氟沙星表现为较强的基质增强效应外，其他抗生素则均表现出基质弱抑制效应(见图7)。

2.4.2 检出限、定量限、线性范围

如表2所示，在优化实验条件下，用空白样品提取液将混合标准储备液稀释，配制成0.1～100 μg/L系列基质匹配标准溶液。各目标物在线性范围内呈良好的线性关系，相关系数r均大于0.99，独立测定样品7次，测定其标准偏差，按照文献[33-34]计算出目标物的检出限(limit of detdction,LOD)为0.02～2.49 μg/kg，定量限(limit of quabtitation,LOQ)为0.06～9.95 μg/kg。

表2 空白基质中9种抗生素的线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.4.3 回收率和精密度实验

按照节1.2的实验方法进行样品前处理，用上海青的空白基质为样品，添加10，50，100 μg/kg 3种添加水平，每个添加水平平行测定7次，计算平均回收率和相对标准偏差。9种抗生素在10，50，100 μg/kg 3个添加水平下的回收率为76.6%～123.7%，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)(n=7)为0.3%～11.0%，方法精密度高(见表3)。

表3 9种抗生素在样品中的回收率及相对标准偏差(n = 7)

2.5 实际样品测定

从厦门市农贸市场随机购买10份上海青样品，采用本方法对9种抗生素进行分析测定。结果表明，7份检出达氟沙星1.05～5.28 μg/kg，2份检出环丙沙星1.29，1.75 μg/kg，1份检出恩诺沙星2.25 μg/kg,其余抗生素均未检出。陈乾等[35]对4种市售蔬菜进行检测，抗生素残留范围为1.59～32.01 μg/kg，本研究测得数值低于该文献的结果。

表 4 实际样品中各样品的9种抗生素残留量平均值及其标准差

3 结 论

本文以上海青为实验对象，通过优化样品前处理和质谱条件，建立同时测定上海青中 3 种氯霉素类和 6 种喹诺酮类抗生素残留UPLC-MS/MS检测方法。该方法操作简单、净化效果好，适用于上海青中氯霉素类和喹诺酮类抗生素的检测。