猪骨髓源树突状细胞与单核细胞源树突状细胞体外培养和功能鉴别

倪 博，张珍珍，袁 厅，张 磊，王海燕，甘 源，冯志新

（江苏省农业科学院兽医研究所 农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室，南京 210014）

树突状细胞（dendritic cells, DCs）是最强有力的专职抗原呈递细胞（Antigen-presenting cells,APCs），广泛的分布在机体黏膜组织中，DCs形态与一般细胞不同，表面富含突起，有利于抗原的捕获，时刻监测着病原体的入侵，在天然免疫和获得性免疫中均发挥重要作用[1]。虽然DCs在体内的分布很广泛，但是含量很少，因此，研究中多使用细胞因子在体外诱导培养。以往猪源DCs的体外培养主要来源于外周血单核细胞[2]，近两年来有学者开始使用猪骨髓作为分离来源[3-4]，但是并没有对两种不同来源的DCs功能及特性进行比较。本研究将比较这两种来源的猪DCs的基本特性，包括DCs吞噬、迁移和刺激淋巴细胞功能，为DCs在不同体外模型中的应用提供选择依据。

1 材料与方法

1.1 实验猪及试剂选取本实验室通过零天断奶技术培育的3～4月龄健康猪，经检测猪肺炎支原体、圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征等病原体的抗原和抗体均阴性。RPMI 1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司；重组猪细胞集落刺激因子GM-CSF和重组白细胞介素IL-4购自R&D公司；脂多糖LPS购自Sigma公司；PE标记的小鼠抗MHCⅡ抗体、PE标记的小鼠抗CD172a抗体购自Abcam公司；TranswellTM细胞板（孔径8 μm）购自Corning公司；细胞筛（40 μm）购自WHB公司；淋巴细胞分离液和配套分离管购自Stemcell公司；结晶紫染色液购自上海翊圣公司。

1.2 猪DCs的分离和培养

1.2.1 猪BMDC的分离和培养 将猪股骨完整取出，剥离肌肉组织，放入75%消毒酒精中浸泡消毒，劈开股骨暴露骨髓腔，刮取骨髓，并用预冷的无菌PBS（含0.1 mmol/L EDTA）溶液冲洗，收集细胞混悬液用40 μm细胞筛过滤后，300×g离心5 min收集细胞。裂解红细胞后计数，使用1640无血清培养基重悬细胞，按照2×106个/mL浓度将细胞加入到6孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，2～3 h后更换为含细胞因子的完全培养基（20 ng/mL GM-CSF[5]和10 ng/mL IL-4[6]）。培养2～3 d换液，并在DCs培养至6 d时，加入LPS（0.1 μg/mL）作用24 h刺激DCs完全成熟。培养过程中随时观察细胞状态和变化。

1.2.2 MoDC的分离和培养 无菌采集肝素抗凝血50 mL，使用淋巴细胞分离液及配套离心管分离外周血单核细胞，300×g离心5 min收集细胞后，按照上述BMDC诱导培养方法进行细胞培养。

1.3 流式细胞术鉴定细胞表型分别收集0、3、6、7 d（6 d+LPS）的BMDC和MoDC，使用PBS（含2%FBS）作为洗液，加入荧光标记的小鼠抗猪CD172a抗体、小鼠抗猪MHC Ⅱ抗体，4℃孵育30 min，细胞洗涤后固定，通过流式细胞仪检测分析。

1.4 DCs吞噬功能试验使用经诱导培养的0、3、6、7 d（6 d+LPS）细胞，计数后按照1×105个细胞重悬于500 μL培养基中，加入等体积0.1%中性红生理盐水溶液，37℃孵育2 h，收集细胞使用PBS洗涤3次，加入500 μL 1%SDS溶液，室温下作用2 h裂解细胞，取100 μL加入ELISA板中，并设置3个重复，检测OD570值，以OD值表示DCs的吞噬能力。

1.5 TranswellTM迁移实验检测猪DCs迁移能力将LPS处理过的BMDC和MoDC计数，同时设置未处理DCs为实验对照，调整为2×105个/100μL细胞悬液，加入TranswellTM上方，下室内加入600 μL 1640培养基（2%FBS，1 μg/mL LPS），37℃孵育2 h。吸去细胞液收集TranswellTM，使用PBS轻柔清洗滤膜2次，再使用结晶紫染色液进行染色，每个样本随机选择5个视野通过倒置显微镜观察，同时收集下室内培养液，对迁移到TranswellTM下方的细胞计数[7]。

1.6 同种异体混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reactions, MLR）淋巴细胞以1×105/100 μL接入96孔板为应答细胞，BMDC和MoDC经LPS处理后作为刺激细胞，按照1∶1、1∶5和1∶10（DCs：lymphocytes）的比例稀释接入细胞孔中，每个样品设置3个重复，并同时设置阴性对照孔（应答细胞）和对照孔（刺激细胞）。37℃培养48～72 h，每孔加入10 μL CCK8溶液，继续孵育4 h，读取OD450数值，按以下公式计算刺激指数（stimulation index, SI）。SI=（试验OD-对照OD）/阴性对照OD[8]。

1.7 统计学分析所有数据采用SPSS 11.5软件包进行分析。计量数据以均数±标准差（±s）表示；各组间数据采用One-way ANOVA（and nonparametric）法检验；P＜0.05表示差异显著，具有统计学意义。

2 结果

2.1 体外培养的猪源DCs数量及形态按照上述分离方法所得的DCs，在体外培养诱导时期，出现聚集成团的半悬浮细胞，呈显示典型的树突状细胞形态。通过激光共聚焦显微镜明场观察，发现DCs单个细胞体积较大、形态不一，表面有数个粗细不等、长短不一的突起（图1），两种来源的DCs形态没有明显差异。在数量上，分离3～4月龄仔猪的两根股骨平均可获得约5×108个前体细胞，50 mL外周血平均可获得约1×108个前体细胞。并且按照Marim的方法[7]，将新鲜分离的前体细胞冻存，复苏后仍可在体外诱导分化为DCs（试验结果未展示）。

图1 激光共聚焦显微镜明场下的MoDC和 BMDC（Bar=14 μm）Fig.1 Morphological features of MoDC and BMDC under light field of laser confocal microscope (Bar=14 μm)

2.2 猪源BMDC与MoDC的细胞表型CD172a和MHCⅡ是表达于DCs表面的两种分子表型，在成熟的DCs表面的表达逐渐增加。本实验中通过流式细胞术检测，可见不同培养阶段的猪DCs均表达CD172a和MHCⅡ（表1）。猪源BMDC与MoDC表面MHCⅡ初始表达较低，随着培养日龄的增长不断增长，7 d（LPS刺激后）细胞表面MHCⅡ表达显著上升，其中BMDC表面MHCⅡ在3、6、7 d的表达量均显著高于MoDC。CD172a初始表达较高，随后也逐渐增长，在LPS刺激后高度表达89.3%（BMDC）和91.5%（MoDC），MoDC表达略高于BMDC，但无显著差异。

表1 不同时间点DCs表型分子的表达率Table 1 Phenotypic molecules of DCs at days 0, 3, 6 and 7

2.3 猪源BMDC与MoDC抗原捕获能力差异体外诱导培养的DCs随着培养天数的增加其吞噬能力相应增强，MoDC的吞噬能力在6 d时达到高峰，显著高于6 d的BMDC，加入LPS刺激后，吞噬功能有所下降。0 d的BMDC即表现出较强的吞噬能力，在3 d时达到高峰，随后吞噬能力显著下降。在0～3 d内BMDC吞噬能力强于MoDC，随后BMDC吞噬能力明显下降，而MoDC继续增长，在6 d时MoDC吞噬能力明显强于BMDC，在加入LPS刺激后两种来源的DCs吞噬能力均下降（图2）。

2.4 猪源BMDC与MoDC迁移能力差异与未处理细胞相比，LPS刺激后的猪DCs附着在TranswellTM滤膜上的紫色细胞数量明显增多（图3A），迁移到下室的DCs数量也明显增多（P＜0.05）（图3B），实验表明成熟的猪DCs具有良好的迁移能力。与BMDC相比，MoDC附着在滤膜上的细胞数量更多，迁移到下室中的细胞量也更多，具有显著差异性，MoDC的迁移能力强于BMDC。

图3 DCs的吞噬功能Fig.3 The phagocytic ability of DCs

2.5 猪源DCs激活淋巴细胞DCs作为刺激细胞与淋巴细胞按照不同比例混合培养，结果显示两种来源的猪DCs均可刺激淋巴细胞增殖，随着DCs稀释比例的增大，淋巴细胞增殖反应越明显。BMDC刺激能力在1∶5时达到顶峰随后略有下降，MoDC则一直增强，在1∶10时淋巴细胞增殖仍小幅上涨。在不同稀释比例下，BMDC刺激淋巴细胞增殖率SI均高于MoDC，在1∶1和1∶5的稀释度下，显著高于MoDC。（图4）

图4 DCs对同种异体淋巴细胞的刺激增殖Fig.4 DCs stimulatory capacity to allogeneic lymphocyte

3 讨论

树突状细胞是一种表面具有树突状突起的免疫细胞，在机体免疫系统中发挥着重要作用。未成熟DCs（immature DCs, imDCs）和成熟DCs（maturer DCs, mDCs）在功能上有较大区别，imDCs具有较强的抗原摄取、加工能力，mDCs则具有较强的抗原提呈能力[9]。本研究中，分别从猪骨髓和猪外周血中分离前体细胞，在体外经细胞因子诱导分化为BMDC和MoDC，通过形态学观察、表型鉴定以及吞噬、迁移和刺激淋巴细胞的能力，对比两种来源DCs的生物学特性。

当抗原进入机体时，能够被DCs捕获。在本研究中，两种来源的DCs均具有较好的抗原摄取能力，早期BMDC的吞噬能力略强于MoDC，6 d的MoDC吞噬能力明显强于BMDC，加入LPS刺激后两种成熟的DCs吞噬能力均下降，与沈海燕等[2]对猪外周血单核细胞来源DCs的生物学特性研究一致，在未成熟期随培养日龄的增长，细胞吞噬中性红的能力逐渐增强，在6 d达到最高，LPS刺激后吞噬功能降低。摄取抗原后，DCs对抗原肽部分进行加工，以便于提呈抗原信息。MHC Ⅱ是DCs抗原提呈中的重要分子[10]，在imDCs中少量表达，随着imDCs的分化成熟，大量的抗原肽-MHC Ⅱ复合物被转运至胞膜表面，有利于抗原信息的提呈。CD172a同样是重要的抗原提呈分子，如在口蹄疫病毒和猪瘟病毒抗原提呈给T淋巴细胞的过程中，CD172a+细胞起重要作用[11]。在本研究中，随着培养日龄的增长，两种来源的DCs细胞表面MHC Ⅱ和CD172a的表达不断增加，与DCs的成熟度呈正相关，其中BMDC表面MHC Ⅱ在3、6、7 d的表达量均显著高于MoDC，骨髓源DCs似乎更易获得高纯度的mDCs。这也可能是培养后期BMDC吞噬能力弱于MoDC的原因。然而，在李宏远等[12]对大鼠DCs的研究中发现，相较于骨髓大鼠外周血则更易获得和诱导高纯度的mDCs，这可能与动物种属不同有关。

当DCs摄取抗原后，开始向局部淋巴结方向迁移，将抗原信息提呈给淋巴结内的T淋巴细胞，激活T细胞介导的免疫应答或维持免疫稳态[13]。在本研究中，LPS刺激后的MoDC和BMDC均具有良好的迁移能力，而且MoDC的迁移能力要强于BMDC。MoDC来源于外周血单核细胞，是外周组织DCs的主体成分，是识别、摄取局部抗原的主力军，逐渐分化成熟后通过淋巴引流管迁移到淋巴结中，激活免疫应答[14]，可能正是如此MoDC具有更强的迁移能力。相较之下，来源于骨髓的BMDC虽然迁移能力稍弱，但是对淋巴细胞的刺激率则更高，据此推测BMDC抗原提呈的效率更高。

Summerfield等[11]研究表明体外使用CSF和IL-4诱导产生的猪源MoDC与人源MoDC相类似，在未成熟时期，是研究DCs成熟过程的优秀细胞模型，在成熟过程中，CD80/86、MHC I和MHC II上调，激活T细胞，同时炎性趋化因子受体CCR1和吞噬能力降低。猪是一种与人相似度极高的哺乳动物，在生理解剖与基因上都十分接近于人，是免疫学研究的理想对象。近年来随着人们对DCs的认识不断深入，DCs相关的免疫学研究，如抗肿瘤、抗感染、器官移植和自身免疫疾病等[15-17]，还有药物、疫苗等筛选[18-19]。猪作为大动物，外周血量较大，股骨、肱骨和肋骨均可用于分离前体细胞，其中外周血取材方便，在试验周期内还可以反复采集。猪可提供大量的、具有功能的、单一实验动物来源的DCs，保证了实验的稳定性和均一性，是免疫学研究的理想对象。猪源DCs或许可以替代人源DCs用于各种免疫学研究中。

本研究结果显示，猪源BMDC的分子表型和功能基本与MoDC相同，其中BMDC吞噬与刺激淋巴细胞能力更强，而MoDC迁移能力更强，本研究可为不同目的实验及不同体外模型中选择合适的DCs提供科学依据。