烘焙程度对小粒咖啡5-羟甲基糠醛生成的影响

刘兴勇，陈兴连，林 涛，王 丽，汪禄祥，李茂萱，邵金良

（云南省农业科学院 质量标准与检测技术研究所，昆明 650205）

咖啡作为世界三大饮料之一，咖啡的消费量一直在增加[1]。咖啡具有提神醒脑、消除疲劳、生津止渴、利尿等功效[2]。咖啡分阿拉比卡（Coffea arabica）、罗布斯塔（Coffea robusta）和利比里亚（Coffea liberica）三大原种，在中国称为小粒、中粒和大粒种咖啡[3]。阿拉比卡咖啡（Coffea arabica）是全球生产最常见的咖啡品种，占咖啡总产量的75%以上[4]。云南是我国小粒咖啡主产区，咖啡种植面积和产量均占到全国的98%以上，云南具有低纬度、高海拔、昼夜温差大等地理环境和气候条件，生产的咖啡具有浓而不苦，香而不烈，略带果酸味等特点[5]。

咖啡的品质取决于烘焙过程和工艺，起始烘焙温度通常在180～250 ℃之间[6]，咖啡中酸类物质（绿原酸、柠檬酸、苹果酸、乙酸、咖啡酰奎宁酸）、生物碱类（咖啡因、葫芦巴碱）、糖类、脂肪和蛋白质等发生不同程度的美拉德、Strecker 降解、焦糖化等反应，生成吡嗪类、呋喃类、吡咯类、吡喃类和吡啶类化合物，还有大量的醛类、酮类、酚类、酯类、醇类化合物，这些化合物形成咖啡的特征风味[7-10]。烘焙咖啡中丙烯酰胺、5-羟甲基糠醛（5-HMF） 和羧甲基赖氨酸等已成为威胁咖啡饮用的安全性问题之一[11-12]。普遍认为，5-HMF 是由于糖等碳水化合物加热分解所形成[13]，Hamzalolu 等[14]认为氨基酸、氨基酸-糖类混合物、维生素、多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素在共同加热过程中也能形成少量的5-HMF。葡萄糖加热转化的呋喃果糖可以促进5-HMF 的形成，5-HMF 是咖啡烘焙过程中形成丙烯酰胺的重要中间体，二者含量呈负相关[15]。富含天门冬酰胺和葡萄糖的食品原料中，葡萄糖和天冬酰胺反应生成丙烯酰胺，进一步加热分解而生成5-HMF；葡萄糖可直接分解为5-HMF，天门冬酰胺和葡萄糖是形成丙烯酰胺及5-HMF 的共同前体反应物。同时，5-HMF 与天冬酰胺反应也能生成丙烯酰胺[16]。5-HMF 与丙烯酰胺呈拮抗作用[15]。5-HMF 是美拉德反应和焦糖化反应的强度指示标志，用来衡量小粒咖啡烘焙热加工过程中非酶促褐变的程度[17]。随着人们生活水平、健康意识不断提升，小粒咖啡的活性成分及其生理功能备受瞩目[5]。5-HMF 作为咖啡烘焙中美拉德反应危害伴生物之一，在高浓度下，对人体黏膜、横纹肌和内脏均具有刺激和损伤作用，具有基因毒性和遗传毒性[18-19]。

目前，对云南小粒咖啡的研究主要集中在生物活性物质、抗氧化功能及品质[20-23]方面，针对烘焙过程中5-HMF 形成研究较少。本文以小粒生咖啡为对象，开展烘焙温度、烘焙时间和烘焙方式对5-HMF 形成的影响，为优化小粒咖啡烘焙工艺和质量控制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铁皮卡、卡蒂姆和卡杜拉生咖啡豆，普洱市思茅区云南咖啡交易中心。烘焙咖啡豆粉碎后过60目筛，盛放于咖啡包装带中，封口备用。

试剂：甲醇、乙腈（HPLC 级），德国Merck 公司产品，正己烷、氯化钠、乙酸钠、无水硫酸镁、冰乙酸（AR 级），国药集团化学试剂有限公司；N-丙基乙二胺（PSA）粉末、C18粉，上海安谱实验科技股份有限公司；实验用水由PURELAB flex 纯水机系统制得，英国埃尔格ELGALabWater 公司。

5-羟甲基糠醛（5-Hydroxymethylfurfural）标准品（≥99%），美国Sigma-aldrich 公司。

1.2 仪器与设备

Waters e2695-2489 高效液相色谱仪、在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、2489 紫外检测器、Empower 3 色谱数据工作站，美国Waters 公司；Gene Cafe 3D 热风咖啡生豆烘焙机，韩国Genesis 公司；JJ200 电子分析天平，江苏省常熟市双杰测试仪器厂产品；KQ500-E 型超声清洗器，江苏省昆山市超声仪器有限公司产品；QL-861 漩涡混合器，江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 烘焙温度烘焙温度为180，200，220，240，250，260 ℃，烘焙时间为10 min，烘焙量为200 g，研究烘焙温度对小粒咖啡5-HMF 形成的影响。

1.3.2 烘焙时间 烘焙时间为6.0，8.0，10.0，12.0，14.0，16.0，20.0 min，烘焙温度为230 ℃，烘焙量为200 g，研究烘焙时间对小粒咖啡5-HMF形成的影响。

1.3.3 烘焙方式[24]烘焙量为200 g，按表1的参数进行烘焙试验，研究不同烘焙方式对小粒咖啡中5-HMF 形成的影响。

表1 咖啡豆烘焙的8 种程度参数Table 1 Parameters of eight roasting degree in roasted coffee

1.4 标准溶液的配制

1.4.1 5-HMF 标准储备溶液 准确称取5-HMF 10 mg（精确到0.0001 g），于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶液溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度为1 000 mg/L 的5-HMF 标准储备溶液，-18 ℃以下避光贮存，有效期12 个月。

1.4.2 5-HMF 标准中间溶液 准确吸取1.0 mL 5-HMF 标准品储备溶液于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，配制成5-HMF 标准中间溶液。-18 ℃以下避光贮存，有效期3 个月。

1.4.3 5-HMF 标准工作溶液 分别吸取5-HMF标准中间溶液0.10，0.20，0.50，1.00，2.50 mL，于10 mL 容量瓶中，用初始流动相定容至刻度，配制成5-HMF 标准工作溶液。现配现用。

1.5 样品的前处理方法

称取粉碎过60 目筛的咖啡样品2 g （精确至0.01 g）于50 mL 离心管中，先加入5 mL 正己烷，超声提取15～20 min，依次加入10 mL 水、10 mL乙腈和0.1 mL 乙酸，旋涡提取3～5 min，最后加入盐析剂（3.0 g NaCl+1.0 g NaAc），去除正己烷，取乙腈溶液5 mL，加入净化剂 （50 mg C18粉+20 mg PSA+200 mg MgSO4），旋涡提取3～5 min，以4 500 r/min 离心5 min 后，取2 mL 乙腈溶液过0.22 μm 滤膜，待测。

1.6 色谱检测条件

Shiseido CAPCELL PAK MG C18色谱柱（150 mm×4.6 mm i.d.，5.0 μm）；柱温30.0 ℃；流动相A为甲醇，流动相B 为水，梯度洗脱程序：0～15 min，10%A，15～20.0 min，10%～60%A，20～25 min，60%～10%A，25～30 min，10%A；流速0.80 mL/min。进样量10.0 μL，检测波长284 nm。

1.7 数据处理

利用Excel 2010 软件对数据进行统计；采用SPSS 22.0 软件 Analyze 模块下的Compare Means 进行方差分析，结果表示为“平均值±标准差”，并进行Duncan's 差异显著性分析，P＜0.05 表示差异显著；通过Excel 2010 进行数据图表的绘制。

2 结果与分析

2.1 烘焙咖啡中5-HMF 含量分析

2.1.1 提取条件的优化 烘焙咖啡基质比较复杂，含有色素、脂肪、蛋白质以及糖类等化合物[25]，常用的净化方法有液液萃取法和固相萃取法，相关文献采用正己烷液液萃取法进行净化[26]，只能去除部分脂类，对咖啡中色素、其它脂类和糖类等杂质的去除效果较差。本试验对提取剂、盐析剂和净化剂进行了优化。结果显示，提取剂为1%乙酸-乙腈溶液，盐析剂为3.0 g NaCl+1.0 g NaAc，净化剂为50 mg C18+20 mg PSA+200 mg MgSO4时，目标峰附近无杂质峰干扰，并且实现了基线分离（见图2），确定的前处理条件分离和净化效果较好，且5-HMF 回收率较好，达到90.6%以上，能够满足试验要求。

图1 5-羟甲基糠醛标准品HPLC 图Fig.1 HPLC chromatogram of 5-hydroxymethylfurfural standard

图2 微中烘焙中5-HMF 的HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of 5-hydroxymethylfurfural in medium roasting degree

2.1.2 线性范围、检出限和定量限 用流动相配制质量浓度为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/L 和50.0 mg/L 的5-HMF 标准工作溶液。在优化后的测定条件下进行测定，以5-HMF 的峰面积（y）对其质量浓度（x） 做工作曲线，5-HMF 在0.5～50.0 mg/L 范围内有良好的线性关系，相关系数（r）为0.9991。以5-HMF 色谱峰3 倍信噪比（S/N）计算检出限（LOD）为0.01 mg/kg，以5-HMF 色谱峰10倍信噪比（S/N）计算定量限（LOQ）为0.03 mg/kg（见表2）。

表2 线性范围、线性方程和相关系数Table 2 Linear ranges，linear regression equation and correlation coefficient

2.1.3 回收率与精密度 微中烘焙的铁皮卡、卡蒂姆和卡杜拉样品中进行低、中、高3 种质量分数（10，20，50 mg/kg）的5-HMF 加标回收试验，每个添加水平做5 组平行试验。5-HMF 的回收率为85.50%～105.5%，相对标准偏差（RSD）为4.28%～7.59%（见表3）。

表3 方法的回收率和精密度（n=5）Table 3 Recovery and precision of the method （n=5）

2.2 小粒咖啡烘焙时间和温度曲线

咖啡生豆本身没有香气，咖啡豆经过烘焙加热，酸类物质、生物碱类、多糖、脂肪和蛋白质等发生诸如焦糖反应、美拉德反应、降解等诸多物理化学以及生化变化，产生咖啡诱人香气和风味[27]，咖啡烘焙加热是一个同时具备传热和传质的复杂过程。本试验小粒咖啡在整个烘烤过程中，自动控温和翻转，以保证受热均匀。将处于室温的咖啡生豆倒入预热后的烘焙机滚筒中，滚筒内的温度会迅速且大幅下降，原先内部积聚的热量被咖啡生豆吸收并使水分蒸发，随咖啡豆表面水分的蒸发流失，咖啡豆表面温度先是趋稳，随即迅速爬升，并在4 min 后达到约115 ℃，随烘焙时间的延长，其烘焙温度呈现升高趋势。铁皮卡、卡蒂姆和卡杜拉的烘焙时间-温度曲线基本相同（图3）。

图3 咖啡的烘焙时间-温度曲线Fig.3 Curve temperature-time of roasting coffee process

2.3 烘焙温度对5-HMF 形成的影响

烘焙温度对铁皮卡、卡蒂姆和卡杜拉中5-HMF 形成的影响如图4所示。

图4 不同烘焙温度对烘焙咖啡5-HMF 形成的影响Fig.4 Effects of different roasting temperature on the formation of 5-hydroxymethylfurfural in roasted coffee

5-HMF 是美拉德反应和焦糖化反应过程中形成的中间产物，其产生受糖的种类、温度、pH值、水分活度、加热时间的影响[28]。图4显示，烘焙温度对小粒咖啡中5-HMF 的生成影响较大，温度为180～240 ℃，随烘焙温度的升高，美拉德反应产物5-HMF 的生成量逐渐增多，240 ℃时达到峰值，铁皮卡为 （28.50±0.15）mg/kg、卡蒂姆为（25.34±0.22）mg/kg、卡杜拉为（16.65±0.19）mg/kg。烘焙温度大于240 ℃，5-HMF 含量随温度的升高而显著下降，260 ℃烘焙10 min 后，5-HMF 含量小于0.05 mg/kg。意味着5-HMF 可通过更高温度的烘焙而减少，小粒咖啡烘焙过程中，温度对5-HMF 的影响较大，240 ℃以上高温能促进烘焙中形成的5-HMF 快速消解。

2.4 烘焙时间对5-HMF 形成的影响

图5显示，烘焙温度为230 ℃，烘焙时间在12 min 内，小粒咖啡的5-HMF 随烘焙时间延长，其含量逐渐增加，烘焙时间为12 min，铁皮卡含量为（27.03±0.27）mg/kg、卡蒂姆（25.10±0.13）mg/kg、卡杜拉（22.99±0.25）mg/kg；烘焙时间大于12.0 min，5-HMF 含量随烘焙时间的延长而显著下降；烘焙时间达到20.0 min，铁皮卡5-HMF 含量（0.315±0.12）mg/kg、卡蒂姆（0.363±0.21）mg/kg、卡杜拉（0.321±0.12）mg/kg，该结果与Kocadağli 等[13]结论一致。说明咖啡烘焙过程中，前期（12 min）加热能促进5-HMF 的生成，烘焙时间大于12 min，烘焙咖啡的5-HMF 明显降低直至消失，230 ℃烘焙20 min 后，其5-HMF 含量低于0.06 mg/kg，可能的原因是5-HMF 降解为有机酸[29]。

图5 不同烘焙时间对烘焙咖啡5-HMF 形成的影响Fig.5 Effects of different roasting time on the formation of 5-hydroxymethylfurfural in roasted coffee

2.5 烘焙方式对5-HMF 形成的影响

烘焙程度对铁皮卡、卡蒂姆和卡杜拉中5-HMF 形成的影响见表4。

小粒咖啡在烘焙加热过程中，水分随温度升高而蒸发。咖啡豆水分降低，体积膨胀，同时发生诸多化学物理变化。随烘焙时间的延长，除水分蒸发，还有其它成分散失，使咖啡豆的质量减少[30]。表4结果显示，随烘焙程度增加，5-HMF 含量呈快速降低趋势，不同烘焙程度咖啡豆中5-HMF 含量差异显著（P＜0.05）。浅烘焙（230 ℃，12 min）和肉桂烘焙（235 ℃，12 min）的烘焙咖啡中，5-HMF含量分别为铁皮卡（30.53±0.45）mg/kg 和（36.76±0.33）mg/kg，卡蒂姆（25.71±0.32）mg/kg 和（18.28±0.41）mg/kg，卡杜拉（17.99±0.48）mg/kg 和（15.25±0.37）mg/kg；烘焙程度达到意式烘焙 （250 ℃，23 min），5-HMF 含量降到最低，铁皮卡（0.21±0.03）mg/kg，卡蒂姆（0.12±0.04）mg/kg，卡杜拉（0.15±0.03）mg/kg，5-HMF 降解率分别为99.31%，99.53%和99.17%。不同烘焙程度的小粒咖啡5-HMF 含量由大到小为浅烘焙＞肉桂烘焙＞微中烘焙＞浓度烘焙＞城市烘焙＞深城市烘焙＞法式烘焙＞意式烘焙。

表4 不同烘焙程度的烘焙咖啡5-HMF 含量（mg/kg）Table 4 Content of 5-hydroxymethylfurfural of roasted coffee in different roasting degree （mg/kg）

烘焙方式看：浅烘焙和肉桂烘焙属于轻度烘焙，烘焙温度和时间均未超过5-HMF 的降解要求，轻度烘焙可使咖啡中累积较高含量的5-HMF；其余烘焙方式在温度和时间上均达到使5-HMF 降解的要求，促进5-HMF 含量显著降低。不同咖啡烘焙方式的5-HMF 含量研究结果与温度和时间结果一致，因此，为控制或者消除咖啡中内源污染物5-HMF 的含量，在保证风味的前体下，可通过调控烘焙的温度和时间减少烘焙咖啡中5-HMF 的含量。

3 结论

采用QuEChERS 净化方法，以乙酸-乙腈溶液为提取剂，氯化钠和乙酸钠为盐析剂，C18粉、PSA 和无水硫酸镁为净化剂，可实现咖啡中5-HMF 的提取、盐析和净化。QuEChERS 净化方法最佳试验条件：提取溶剂为1%乙酸-乙腈溶液，盐析剂为3.0 g NaCl+1.0 g NaAc，净化剂为50 mg C18+20 mg PSA+200 mg MgSO4，5-HMF 的回收率≥85.5%。5-HMF 在0.5～50.0 mg/L 范围内有良好的线性关系，相关系数（r）为0.9991，检出限为0.01 mg/kg，定量限为0.03 mg/kg，在10，20，50 mg/kg 添加水平的回收率为85.50%～105.5%，相对标准偏差为4.28%～7.59%（n=5）。

烘焙温度180～240 ℃，随烘焙温度升高，5-HMF 生成量逐渐增加，到240 ℃时达到峰值，烘焙温度大于240 ℃，急剧下降；烘焙温度为230 ℃，烘焙时间为6～12 min，5-HMF 生成量随烘焙时间延长而增加，烘焙时间为12.0 min，5-HMF 生成量达到最大值，烘焙时间大于12 min，5-HMF 含量显著降低；烘焙程度增加，5-HMF 含量显著降低。小粒咖啡的5-HMF 随烘焙温度、烘焙时间和烘焙程度的改变，是一个逐渐产生、达到峰值和急剧下降的动态变化过程，通过调整烘焙温度、时间来控制咖啡中5-HMF 的形成。