超高效合相色谱法拆分及测定板蓝根中（R，S）-告依春对映异构体含量*

蔡雪萍，朱乃军，钱 啸，陈 蓉，郝 刚

（江苏省苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215104）

板蓝根为十字花科植物菘蓝Isatis indigoticaFortune.的干燥根，其性寒、味苦，有清热解毒、凉血利咽功效［1-2］。现代药理学研究表明，板蓝根具有抗病毒、抗炎、调节免疫等作用［3-5］，临床广泛用于治疗病毒性感冒发热、咽喉肿痛、流行性腮腺炎、扁桃体炎、病毒性肝炎、带状疱疹等疾病。虽然其药效显著，但化学成分复杂，活性指标成分不明，一直是国内外研究的热点［6-9］。板蓝根药材中的R-告依春可发挥抗流感病毒作用［10］，而其对映体S-告依春可导致甲状腺肿大［11］，故分离该对对映异构体具有临床价值。2020年版《中国药典（四部）》中采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定板蓝根中（R，S）-告依春含量［1］，但在该色谱条件下未能分离对映体。高效液相色谱（HPLC）法、气相色谱（GC）法和超临界流体色谱（SFC）法等均在手性化合物分离领域发挥着重要作用［12-14］。近年来，超高效合相色谱（UPC2）法越来越多地应用于手性化合物的分离［15-17］。UPC2基于超高效液相色谱（UPLC）法与SFC，以超临界流体CO2为流动相主体，依靠其溶剂化能力进行分离［15］。采用HPLC法、SFC法分离（R，S）-告依春已有相关研究［18-20］，与HPLC 法比较，UPC2法分析时间短、效率高，且有机溶剂的用量极少，对环境友好；与SFC 法比较，UPC2法具有体系重现性、稳定性更高的优势。UPC2法是一种经济高效、快捷环保的分离方法，可有效弥补HPLC 法和SFC 法在分离手性化合物时的不足。本研究中建立了拆分板蓝根药材中（R，S）-告依春对映体并测定其含量的UPC2法，为手性化合物的拆分和含量测定提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Acquity UPC2型超高效合相色谱仪，包括Empower 3工作站（美国Waters公司）；XSE205DU型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Biofuge Primo R 型高速离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；Direct-Q3 型超纯水机（美国Millipore 公司）；SK8210HP 型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；XMTD-204 型数显式电热恒温水浴锅（上海跃进医疗器械有限公司）。

1.2 试药

（R，S）-告依春对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111753-201706，含量为100.0%）；R-告依春、S-告依春单一对照品（本实验室自制，含量分别为99.82%，99.83%）；板蓝根药材（来源见表1），经本中心中药室鉴定为正品；CO2（苏州市金宏气体股份有限公司，体积分数≥99.995%）；甲醇为色谱纯，水为超纯水。

表1 板蓝根药材来源及批号Tab.1 Sources and batch numbers of Isatidis Radix samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：TrefoilTMAMY1 柱（150 mm × 3.0 mm，2.5 μm）；流动相：CO2（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～4.5 min时95%A→80%A，4.5～5 min时80%A→60%A，5～7 min时60%A，7～8 min时60%A→95%A；8～10 min时95%A）；流速：1.2 mL/min；检测波长：245 nm；柱温：45 ℃；动态背压：1 800 psi；进样量：2 μL。

2.2 溶液制备

取R-告依春、S-告依春对照品各适量，精密称定，以甲醇溶解并制成质量浓度分别为0.321 6，0.161 9 mg/mL的混合对照品溶液；取R-告依春、S-告依春对照品各适量，精密称定，分别以甲醇溶解并制成质量浓度分别为0.046 0，0.044 1 mg/mL 的单一对照品溶液。取药材样品粉末（过4 号筛）0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20 mL 水，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz）提取60 min，放至室温，再次称定质量，用水补足减失的质量，摇匀并静置5 min，取上清液，12 000 r/min离心5 min，取上清液5 mL 置坩埚中，蒸干，以甲醇复溶并定容至5 mL，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：精密量取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液各2 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱中，在与混合对照品溶液色谱相应位置有吸收峰，分离度均大于1.5。详见图1。

线性关系考察：分别取混合对照品溶液适量，以甲醇稀释制成R-告依春质量浓度为2.01，4.02，8.04，16.08，32.16，64.32 μg/ mL，S-告依春质量浓度为1.01，2.02，4.05，8.10，16.19，32.38 μg/mL 的系列混合对照品溶液，各量取2 μL，按2.1 项下色谱条件进样测定。以R-告依春、S-告依春的质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程R-告依春为Y1=10 469X2+1 563.7（r=0.999 9，n=6），S-告依春为Y2=10 229X2+873.1（r=1.000 0，n=6）。结果表明，R-告依春和S-告依春质量浓度分别在2.01～64.32 μg/mL和1.01～32.38 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

检测限与定量限考察：分别取2.2 项下R-告依春和S-告依春单一对照品溶液各适量，倍比稀释，按2.1项下色谱条件进样测定，以信噪比（S/N）3∶1和10∶1时的质量浓度记作检测限和定量限。结果R-告依春和S-告依春的检测限均为0.09 μg/mL，定量限分别为0.46 μg/mL和0.44 μg/mL。

精密度试验：取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果R-告依春和S-告依春峰面积的RSD分别为0.25%和0.24%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2 项下供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果R-告依春和S-告依春峰面积的RSD分别为2.50%和2.39%（n=6），表明供试品溶液室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取药材样品（批号为AG1180402001）粉末适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，共6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定。结果R-告依春和S-告依春含量的RSD分别为1.80%和1.86%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的药材样品（批号为AG1180402001）粉末0.2 g，共6份，分别精密加入0.5 mL混合对照品溶液，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 样品含量测定

取药材样品粉末适量，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，按外标法测定样品中R-告依春和S-告依春的含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（%，n=3）Tab.3 Results of the content determination of R-goitrin and S-goitrin in the samples（%，n=3）

3 讨论

3.1 单一对照品的制备与纯化

基于Waters Prep SFC 80制备型超临界流体色谱系统结合REGIS（S，S）-Whelk-O1型（250 mm×30 mm，10 μm）手性制备色谱柱制备2种对映异构体，其色谱条件参考文献［21］，并在此基础上进行优化，最终确定流动相为超临界CO2和乙醇（含0.1% NH3·H2O，20∶80，V/V），流速为8 mL/min，动态背压为1 450 psi，紫外检测波长为220 nm，进样量为2 μL。分离得到的2 个组分分别经25 ℃旋转蒸发干燥和冷冻干燥，再经旋光鉴定及纯度检测，最终获得R-告依春对照品及S-告依春对照品。

3.2 色谱柱选择

预试验中分别考察了TrefoilTMAMY1 柱（150 mm×3.0 mm，2.5 μm），TrefoilTMCEL1柱（150 mm×3.0 mm，2.5 μm），TrefoilTMCEL2柱（150 mm×3.0 mm，2.5 μm），结果TrefoilTMCEL1柱和TrefoilTMCEL2柱不能完全分离该对对映异构体，分离度小于1.5；而TrefoilTMAMY1 柱分离效果较好，分离度可达1.98。故选择TrefoilTMAMY1手性色谱柱用于R-告依春及S-告依春的分离。

3.3 样品处理方法确定

预试验中分别比较了水煎煮［1］和超声提取方法，水、50%甲醇、甲醇为提取溶剂，0.5，1，2 h 提取时间对（R，S）-告依春提取效率的影响。结果超声提取法的提取效率明显高于水煎煮法。有文献报道，温度越高，（R，S）-告依春稳定性越低［22］，故长时间的高温水煎煮使得（R，S）-告依春的稳定性下降，导致其含量降低；以水为提取溶剂时，UPC2法测得的R-告依春和S-告依春含量最高，且明显高于以50%甲醇及甲醇作为提取溶剂时的含量，表明两者在水中的溶解度高。以水为提取溶剂对药材样品进行超声提取时，随着超声时间的延长，提取效率随之提高，但超声时间＞1 h 时，两者的含量均不再明显增加，故最终选择超声时间为1 h。

3.4 样品含量测定结果

由本研究结果可知，不同厂家板蓝根药材中R-告依春的含量均明显高于S-告依春（约为后者的2 倍）。推测R-告依春的含量可能是影响板蓝根制剂抗病毒效果的关键因素。

3.5 方法评价

本研究中采用UPC2法拆分板蓝根药材中抗病毒活性成分R-告依春及其对映异构体S-告依春，并建立了两者的含量测定方法。该方法稳定性、重复性均较好，结果准确可靠，且环保，为（R，S）-告依春手性化合物的分离开拓了新思路，对于板蓝根药材及其制剂的质量控制也有一定指导意义。