西帕依固龈液成分鉴定及其治疗复发性阿弗他溃疡作用机制的网络药理学研究*

马 璇，范晨阳，季志红，李柯翱，聂继红

（1.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新奇康药业股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830011；3.新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000）

复发性阿弗他溃疡（RAU）为临床常见口腔黏膜疾病，常反复发作，病因尚不明确，主要与遗传及免疫、细菌因素、微量元素缺乏及食物抗原、精神因素、机械损伤、系统疾病及激素紊乱、氧化应激等有关［1-2］。目前多采用局部治疗与全身治疗相结合，以达到缩短溃疡发作期、延长间歇期、减轻疼痛和减少溃疡数量的目的［3］。西帕依固龈液以没食子为原料经现代工艺制成，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》［4］，有健齿固龈、清血止痛等功效，用于治疗口腔疾病。临床研究表明，西帕依固龈液可明显减少复发性口腔溃疡数，缩小溃疡直径，对口腔黏膜无刺激性［5-6］。本研究中通过网络药理学手段分析西帕依固龈液中化合物可能的作用靶点及作用途径，预测其治疗RAU的机制。现报道如下。

1 化学成分鉴定

1.1 仪器与试药

仪器：H-Class 型超高效液相色谱仪及XEVO-G2XS QTOF型质谱仪（美国Waters公司）。

试药：西帕依固龈液（新奇康药业股份有限公司，批号为20190905）。

1.2 方法与结果

1.2.1 试验条件

色谱条件：色谱柱为Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～1 min时1%B，1～5 min时10%B，5～50 min时25%B，50～80 min时30%B，80～90 min 时50%B，90～100 min 时90%B）；流速为0.8 mL/min。

质谱条件：负电离（ES-）扫描模式，毛细管电压2.5 kV；样品锥孔电压40.0 kV，源温度100 ℃，去溶剂温度250 ℃，锥孔气流量50.0 L/h，去溶剂气流600.0 L/h。

1.2.2 试验结果

采用液相色谱-质谱法分析，结果见图1。经过分子量比对，查阅文献［7-8］，鉴定出8 种化学成分，详见表1。

表1 西帕依固龈液化学成分鉴定结果Tab.1 Identification of chemical components in Xipayi Mouth Rinse Fluid

2 网络药理学研究

2.1 活性成分及靶点收集

文献挖掘西帕依固龈液中8个化学成分，质谱分析得11个化学成分，去重后共获得914个靶点。

2.2 RAU 疾病靶点收集

以“recurrent aphthous ulcer（stomatitis）”为关键词在DisGeNET，Human Phenothpe Ontology 和DrugBank 数据库进行搜集，分别获得RAU基因27，11，117个；从GEO数据库（系列：GSE37265）获得RAS的差异表达基因，利用RStudio进行分析，共获得差异表达基因80个，前20个见图2（红色代表基因上调，黑色代表未发生差异表达，绿色代表基因下调）。获得的差异表达基因作为RAU 的相关靶点，与DisGeNET、Human Phenothpe Ontology和DrugBank数据库获得的靶点取交集，共获得206个疾病靶点。

2.3 复方靶点网络构建、基因本体论（GO）富集及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析

将西帕依固龈液活性成分914 个靶点与RAU 疾病206 个靶点取交集，获得33 个靶点。反向寻找，获得5 个对应的化学成分（见表2），导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建复方靶点的网络图，结果见图3（绿色代表活性成分，红色代表基因）。

表2 西帕依固龈液治疗RAU靶点对应化学成分Tab.2 Chemical components corresponding to the target of Xipayi Mouth Rinse Fluid in the treatment of RAU

对33 个基因进行GO 富集分析，共获得920 项，其中生物过程（BP）877 项，细胞成分（CC）10 项，分子功能（MF）33 项（P＜0.01），P值较小的前10 项富集结果见图4。前3个生物过程为对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、细胞因子产生的正调控，前3 大细胞组成为膜筏、膜微区、膜区，前3 项分子功能为细胞因子活性、细胞因子受体结合、受体配体活性。

对33个潜在基因进行KEGG通路分析，共获得12条通路（P＜0.01），结果见图5。前4条信号通路为NF-κB信号通路、HIF-1 信号通路、程序性坏死、细胞因子-细胞因子受体相互作用。

3 讨论

本研究中利用液相色谱/质谱和网络药理学技术构建了西帕依固龈液治疗RAU 的靶点网络。结果表明，西帕依固龈液中5个化学成分对多个靶点均有影响，如没食子酸、鞣花酸和棕榈酸分别作用于FAS 和CYP2E1靶点。没食子酸类物质具有抗癌［9］、抑菌［10］、抗炎［11］、抗病毒［12］、促进细胞凋亡［13］等多种药理活性。鞣花酸清除自由基的能力很强，具有抗氧化［14］作用，还可通过影响NK细胞活性而起到一定的免疫调节作用［15］。

目前的研究认为，RAU 的发生、发展与细胞因子如白细胞介素（IL）、干扰素（IFN）、肿瘤坏死因子（TNF）以及转化生长因子（TGF）有关，包括IL-6，IL-10，IL-4，IL-18，IFN-γ，TNF-α，TGF-β 等［16-18］。网络药理学分析发现，西帕依固龈液治疗RAU 最相关的通路为NF-κB 信号通路、低氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路、程序性坏死与细胞因子-细胞因子受体相互作用，通路中涉及的抗炎、镇痛相关靶点包括IL-6，TNF，FAS 等，与目前研究的RAU 主要靶点相一致。临床研究表明，西帕依固龈液能降低慢性牙周炎患者龈沟液中的TNF-α，IL-6，IL-8 水平，升高超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平［19］。西帕依固龈液能抑制模型大鼠牙龈炎牙龈组织中核因子（NF）-κB-p65 和环氧合酶（COX-2）的表达［20］；同时，西帕依固龈液可明显抑制前列腺素E2（PGE2）的合成与分泌［21］。没食子提取物可抑制口腔细菌生物膜中葡萄糖转移酶的（GTF）活性，发挥防龋作用［22］。

IL-6 是炎性疼痛的重要参与因子，可通过增加TNF-α，诱导产生前列腺素而引起疼痛反应［15］。此外，RAS 的发生也有细菌因素，正常人群口腔内细菌的种类主要由9个细菌门组成，RAU患者口腔菌群发生了改变［2，23］。酶促抗氧化系统在RAU 的发病机制中起了关键作用，RAU 患者血清中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、TNF-α、髓过氧化物酶（MPO）、总氧化状态（TOS）水平和氧化应激指数（OSI）升高，一氧化氮（NO）、IL-10和抗氧化状态（TAS）水平降低［24-25］。

综上所述，西帕依固龈液所含没食子酸等核心成分能作用于TNF，IFN-γ 等基因，继而调控NF-κB，HIF-1等多条信号通路，从而发挥治疗RAU的作用。