泥鳅蛋白多肽的抗氧化活性

吕新河， 朱云龙*，2

（1.南京旅游职业学院 烹饪与营养学院，江苏 南京 211100；2.扬州大学 旅游烹饪学院·食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127）

泥鳅作为我国极具特色的淡水鱼类，具有重要的经济以及研究价值[1]。泥鳅适应环境能力强且营养丰富[2-3]，近年来得到国内外学者的广泛关注以及挖掘研究。目前市场上关于泥鳅蛋白产品的开发研究大多聚焦于泥鳅相关的粗加工品，均未能将泥鳅体内的活性成分深度运用[4-6]。在上述背景下，作者以泥鳅为原料，提取蛋白多肽并进行体外抗氧化活性以及体内抗氧化活性研究，为泥鳅蛋白的深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

泥鳅：购自南京市众彩批发市场；60只5周龄的（20.0±2.0）g SPF级雌性小鼠：购自常州卡文斯实验动物有限公司。

碱性蛋白酶（酶活为120 000 U/g）、GSH-Px试剂盒、MDA试剂盒、SOD试剂盒：购自南京建成公司；其余均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FA3204电子分析天平：上海邦亿精密量仪有限公司产品；723N可见分光光度计：上海佑科仪表有限公司产品；ULT1386-3-V超低温冰箱：美国REVCO公司产品；ALPHA 1-2LD PLUS冻干机：德国Marin Christ公司产品；L4-6KR低温离心机：深圳三利仪器有限公司产品；LM纤维超滤装置：博纳机械设备有限公司产品；高压灭菌锅：山东博科有限公司产品；SYC恒温水浴锅：上海耀特仪器有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 泥鳅蛋白多肽的制备参考高丹丹等[7]的制备方法，并稍做修改。称取固定质量的样本，只取样本的肌肉组织进行均质处理，按料液质量体积比1 g∶40 mL与去离子水混合，混合均匀后，用1 mol/L的NaOH将pH调节至10.0，加入碱性蛋白酶反应（加酶量1 500 U/g）2 h，沸水浴灭酶8 min，水解产物在6 000 r/min的条件下离心15 min，取上清液并通过可截留相对分子质量为10 000的平板膜，收集相对分子质量小于10 000的酶解液，冷冻干燥24 h后获得泥鳅蛋白多肽。

1.3.2 体外抗氧化活性研究

1）羟自由基（·OH）清除能力的测定 羟自由基（·OH）清除能力的测定参照李亚会等[8]方法，并在此基础上稍做改进。将制得的泥鳅蛋白多肽用蒸馏水调制为不同质量浓度蛋白多肽溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。取1.0 mL 9.0 mmol/L FeSO4·7H2O溶液、1.0 mL 9.0 mmol/L水杨酸-乙醇、1 mL泥鳅蛋白多肽，最后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2，37℃的条件下水浴加热0.5 h，测定510 nm处的吸光度，记为A1；以蒸馏水替换过氧化氢以及泥鳅蛋白多肽溶液（受测溶液），重复以上实验，测得吸光度分别记为A2以及A0。按照式（1）计算羟自由基（·OH）清除率I1，以VC作为对照，评价其消除能力，实验重复3次，并对结果进行统计分析。

2）ABTS自由基清除能力的测定ABTS自由基清除能力的测定参照Yap等[9]方法，并在此基础上稍做改进。实验步骤如下：将制得的泥鳅蛋白多肽用蒸馏水调制为不同质量浓度溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。取0.2 mL 7.4 mmol/L ABTS和0.2 mL 2.6 mmol/L K2S2O8，室温避光环境中混合静置15 h。取磷酸缓冲溶液（pH 7.4）将混合静置试剂稀释50倍作为ABTS工作液。将0.2 mL体积分数95%乙醇溶液与0.8 mL ABTS工作液混合静置6 min，在734 mm下测定吸光度，记作A10；用受测溶液替换体积分数95%乙醇溶液，重复以上实验，记为A。按照式（2）计算ABTS自由基清除率I2，以VC作为对照，实验重复3次，并对结果进行统计分析。

3）DPPH自由基（DPPH·）清除能力的测定DPPH自由基（DPPH·）清除能力的测定参考刘沙等[10]的方法，并稍做修改。实验步骤如下：将制得的泥鳅蛋白多肽用蒸馏水调制为不同质量浓度溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。量取2.0 mL调配好的泥鳅蛋白多肽溶液与2.0 mL DPPH·乙醇溶液混合，常温下反应0.5 h，测定517 nm的吸光度，记作A20。取2.0 mL DPPH·乙醇溶液与2.0 mL无水乙醇重复以上步骤，测定吸光度记作Ac。取2.0 mL泥鳅蛋白多肽溶液与2.0 mL无水乙醇溶液重复以上步骤，测定值记作A30。按照式（3）计算DPPH自由基（DPPH·）清除率I3，以VC作为对照，实验重复3次，并对结果进行统计分析。

1.3.3 体内抗氧化活性研究

1）动物实验设计 动物实验设计参考文献[11~13]实验方法，并作修改。选取60只5周龄的SPF级雌性小鼠，体质量为（20.0±2.0）g，在温度20～22℃、湿度40%～60%、明暗交替喂养12 h的条件下进行喂养，适应性喂养7 d后，将实验所选取的60只小鼠随机分为以下6组：空白对照组、模型对照组、多肽高剂量组、多肽中剂量组、多肽低剂量组、VC对照组。空白对照组仅每天皮下注射生理盐水，其余各组小鼠每天颈部皮下注射D-半乳糖（200 mg/kg）；空白对照组和模型对照组每天灌胃0.2 mL 0.9 g/dL生理盐水；在每天灌胃0.2 mL 0.9 g/dL生理盐水的基础上，分别用质量分数为200、400、800 mg/kg的泥鳅蛋白多肽进行灌喂小鼠，分别作为多肽低剂量组、多肽中剂量组和多肽高剂量组；VC对照组每天按300 mg/kg剂量的VC进行灌喂。连续注射、灌胃6周，每周对小鼠进行一次体质量称量，以调整注射量以及灌胃量。

2）样品采集 参考文献[14-16]实验方法，并作修改。实验期结束后，禁食不禁水12 h后对小鼠进行眼球取血，在4℃、3 500 r/min条件下离心10 min用于制备血清。对小鼠进行断颈处死，取出小鼠肝脏以及心脏，清洗干净后，称取适量肝脏组织及心脏组织加入生理盐水，快速制备质量浓度为10 g/mL的组织匀浆，在4℃、3 500 r/min的条件下离心10 min获取组织上清液。

3）生化指标的测定 小鼠的血清、肝脏及心脏中的SOD活性、MDA水平以及GSH-Px活性测定参考试剂盒说明书。

4）肝脏HE染色切片 参照文献[17-20]对动物组织切片的处理方法，小鼠肝脏组织取样后放入固定液中完成固定，肝脏HE染色切片制作由扬州大学医学院完成。

1.4 数据处理

本实验中检测数据以均数±标准差表示，数据分析运用SPSS 19.0软件。运用Microsoft Excel 2003软件绘制统计图。

2 结果与分析

2.1 泥鳅蛋白多肽的体外抗氧化活性研究

2.1.1 泥鳅蛋白多肽对·OH清除能力的影响大量实验证据表明，体外·OH清除能力的强弱能有效反映抗氧化物抗氧化能力[21-22]。以VC作为对照组，测定不同质量浓度受测溶液对·OH的清除效果，结果见图1。当受测溶液质量浓度在0.2 mg/mL时，泥鳅蛋白多肽·OH的清除率为33.2%，与VC的·OH的清除率相比差异性显著；当受测溶液质量浓度高于1.0 mg/mL时，泥鳅蛋白多肽的·OH清除率与0.2 mg/mL受测溶液的清除率相比显著提升，达到59.6%，与同质量浓度的VC相比，达到了其清除率的64.4%。这说明泥鳅蛋白多肽具有一定的清除·OH的能力。

图1 泥鳅蛋白多肽对·OH清除能力的影响Fig.1 Scavenging effect of the antioxidant activity of the polypeptidet of the loach extract on·OH

2.1.2 泥鳅蛋白多肽对ABTS自由基清除能力的影响清除ABTS自由基的能力是总抗氧化能力的重要体现[23-25]。以VC作为对照组，测定不同质量浓度受测溶液对ABTS自由基的清除能力，结果见图2。当受测溶液质量浓度低于0.4 mg/mL时，对ABTS自由基清除率较低且清除率的提升不明显，其中质量浓度在0.4 mg/mL时对ABTS自由基的清除率为16.3%；当受测溶液质量浓度为0.6 mg/mL时，对ABTS自由基的清除率出现显著提高，清除率达到24.9%；当受测溶液质量浓度达到1.0 mg/mL时，对ABTS自由基的清除率为41.6%。这表明当质量浓度在0.2~1.0 mg/mL时，泥鳅蛋白多肽对ABTS自由基的清除能力与VC相比仍然有限。

图2 泥鳅蛋白多肽对ABTS自由基清除能力的影响Fig.2 Scavenging effect of the antioxidant activity of polypeptide of the loach extract on ABTS

2.1.3 泥鳅蛋白多肽对DPPH·清除能力的影响DPPH·清除率是衡量抗氧化物质体外抗氧化能力最为重要的指标之一[26-28]。将VC作为对照组，测定不同质量浓度受测溶液对DPPH·的清除效果，结果见图3。VC的清除率在质量浓度达0.4 mg/mL时，已经开始趋于稳定，并接近于最大清除率；当质量浓度处于1.0 mg/mL时VC的清除率高达91.1%，这说明VC的DPPH·清除率已基本趋于稳定并接近清除率的极限。当受测溶液的质量浓度低于0.2 mg/mL时，DPPH·清除率相对比较低；当达到0.4 mg/mL及以上质量浓度时，受测溶液的DPPH·清除率开始呈现出显著变化；当受测溶液质量浓度达到1.0 mg/mL时，DPPH·清除率明显增高（清除率为55.6%），并出现显著差异。虽然受测溶液与VC相比DPPH·清除率具有显著的差异性，但实验结果表明泥鳅蛋白多肽仍具有一定的清除DPPH·的能力。

图3 泥鳅蛋白多肽对DPPH·清除率的影响Fig.3 Scavenging effect of the antioxidant activity of the polypeptide of the loach extract on DPPH·

2.2 泥鳅蛋白多肽体内抗氧化活性分析

2.2.1 泥鳅蛋白多肽对小鼠血清的影响由表1可得，小鼠血清的测定中空白对照组与模型对照组各指标均存在极显著差异。SOD活性的测定中，模型对照组与泥鳅蛋白多肽低剂量组之间具有明显差异（P<0.05），其中与模型对照组相比，多肽低剂量组SOD活性在数值上提升了19.2%；而多肽中剂量组与高剂量组之间的差异并不明显，在数值与模型对照组相比上分别提升了31.8%和36.6%，这可能是由于泥鳅蛋白多肽对小鼠血清的影响已经基本达到了最大化。结果表明泥鳅蛋白多肽对小鼠血清SOD活性有影响，并且在800 mg/（kg·d）时接近最佳效果。MDA活性测定中，对比模型对照组，泥鳅蛋白多肽中、高剂量组均能够有效抑制小鼠血清脂质过氧化的发生，其中泥鳅多肽中剂量组对比模型对照组MDA降低了11.4%，具有显著降低效果；泥鳅多肽高剂量组则降低了16.2%，具有极显著降低效果。GSH-Px活性的测定中，泥鳅多肽低、中、高剂量组的活性均显著高于模型对照组（P<0.05），随着剂量的增加，活性显著增强。

表1 泥鳅蛋白多肽对小鼠血清的影响Table 1 Loach polypeptide extracts on mice

2.2.2 泥鳅蛋白多肽对小鼠肝脏的影响受测小鼠肝脏中SOD活性、MDA水平以及GSH-Px活性相关结果见表2。肝脏的测定结果中空白对照组与模型对照组各指标均存在显著差异。SOD活性测定中，模型对照组与多肽低剂量组之间不存在显著差异（P＞0.05）。在多肽中、高剂量组中可看出随着泥鳅蛋白多肽质量分数的升高SOD活性出现明显提升（P<0.01），其中多肽高剂量组与模型对照组相比数值提升了28.1%，说明泥鳅蛋白多肽能够明显提升小鼠肝脏中SOD活性，但剂量要达到一定数值。MDA活性测定中，泥鳅蛋白多肽的中、高剂量组数值均明显低于模型对照组，其中多肽高剂量组有效降低了18.3%，说明泥鳅蛋白多肽能够显著的抑制肝脏组织脂质过氧化的发生。与模型对照组相比各剂量组的多肽均能有效提升小鼠肝脏GSH-Px活性，与模型对照组相比较，多肽低、中、高3个剂量组分别提升了40.8%、88.9%、132.2%，并且有很好的剂量效应关系。实验结果中的泥鳅蛋白多肽高剂量组能够显著提升GSH-Px活性。

表2 泥鳅蛋白多肽对小鼠肝脏的影响Table 2 Loach polypeptide on mice with the effect in the liver

2.2.3 泥鳅蛋白多肽对小鼠心脏的影响受测小鼠心脏中SOD活性、MDA水平以及GSH-Px活性相关结果见表3。小鼠心脏的测定结果中空白对照组与模型对照组的各指标均存在显著差异。SOD活性的测定中，与模型对照组相比，多肽高、中、低3个剂量组均能不同程度地提升SOD活性（分别提升22.3%、12.5%、7.5%），其中多肽中、高剂量组能极显著提高小鼠心脏组织SOD活性。模型对照组小鼠心脏的MDA水平高于多肽中、高剂量组，多肽中、高剂量组对比模型对照组在MDA水平上分别有效降低了21.1%以及26.2%，这表明泥鳅蛋白多肽能够在一定程度上减弱心脏组织的脂质过氧化反应带来的致衰效果。GSH-Px活性的测定中，从多肽低剂量组开始与模型对照组之间呈现出上升趋势，多肽低、中、高3个不同剂量组数值上分别提升了24.6%、66.9%、92.5%，这表明多肽中、高剂量组能够有效提升小鼠心脏GSH-Px活性。

表3 泥鳅蛋白多肽对小鼠心脏的影响Table 3 Loach polypeptide on mice with the effect in the heart

2.2.4 泥鳅蛋白多肽对小鼠肝脏组织结构的影响小鼠肝脏组织染色切片（HE染色，200×）如图4所示。由图可见，空白对照组中的肝脏细胞肝索排列有序且肝窦大小正常，细胞凋亡情况不明显。模型对照组中肝窦大小出现异常情况，肝索排列混乱，其中出现了明显的细胞凋亡现象。不同剂量的泥鳅蛋白多肽组与模型对照组比较可以看出，肝窦扩大的情况趋于减少，肝索随着剂量的增加趋于正常，细胞凋亡情况有所缓解。这再次表明泥鳅蛋白多肽对减少肝脏因氧化应激而产生的损伤具有一定的作用。

图4 小鼠肝脏组织切片Fig.4 Histopathology of liver

3 结语

实验表明，当泥鳅蛋白多肽质量浓度达到1.0 mg/mL时，·OH、ABTS自由基和DPPH·清除率分别达到了59.6%、41.6%以及55.6%。这说明泥鳅蛋白多肽在体外具有有效的清除·OH、ABTS自由基以及DPPH·的能力。体内抗氧化实验中，多肽高剂量组中血清、肝脏、心脏的SOD活性与模型对照组相比分别提升36.6%、28.1%以及22.3%，GSH-Px活性分别提升43.2%、132.2%以及92.5%，MDA水平分别降低了16.2%、18.3%以及26.2%。实验说明，泥鳅蛋白多肽具有提高小鼠血清、肝脏以及心脏组织SOD活性和GSH-Px活性，同时能够抑制小鼠MDA水平的作用。肝脏组织切片表明泥鳅蛋白多肽对小鼠肝脏免受因氧化应激而产生的损伤具有一定效果。本实验结果对泥鳅蛋白多肽以及其深加工产品提供了参考。