广东省凤尾蕨属植物抗白血病药物研究

曾德贵，冯东辉

（1.广东省深圳市慢性病防治中心，广东 深圳518020；2.中国科学院大学深圳医院，广东 深圳 518107）

凤尾蕨属植物为传统中药材，目前已发现300余种该属植物，我国约有66种，有24种可入药［1］。半边旗Pteris semipinnataL、剑叶凤尾蕨Pteris ensiformisBurm、刺齿凤尾蕨Pteris disparkze、蜈蚣草Pteris vittata和井栏边草Pteris multifida是广东地区常见的凤尾蕨属植物，具有清热利湿、利尿、消食、杀虫等功效，民间常用于治疗疳疮、湿疹、蛇虫咬伤等［2］。半边旗的水提物和醇提物抗肿瘤作用好，且无明显毒性［3］，其作为民间常用中草药被收载为广东地区地方习用药材标准品种，其余4种药用植物的抗肿瘤研究在国内外均少见报道。为了充分利用广东地区的中草药资源，本研究中探讨了这5种药物对人早幼粒白血病HL−60细胞株（简称HL−60细胞）和人慢性髓样白血病K562细胞株（简称K562细胞）的生长抑制作用，以开发新的抗白血病药物。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：371型CO2孵箱、ST 40R型超速离心机（美国Thermo Fisher公司）；ME104E型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为0.001 g）；Malab WT100−2型水浴箱（杭州米欧仪器有限公司）；索氏提取器（北玻股份有限公司，规格为50 mL）；37XB型倒置生物显微镜（上海豫光仪器有限公司）。

试药：半边旗、剑叶凤尾蕨、刺齿凤尾蕨、蜈蚣草均采自广东湛江湖光岩地区，井栏边草采自广东省广州市郊，经广东省中药研究所曾庆钱主任中药师鉴定均为正品；RPMI−1640培养基（美国Gibco公司，批号为1737734）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号为20190202）；甲醇、乙醇、二甲基亚砜均为分析纯。

细胞：HL−60细胞（上海生物化学与细胞生物学研究所）；K562细胞（广州市肿瘤研究所）。

1.2 方法

细胞培养：将HL−60细胞和K562细胞置含10%灭活小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI−1640完全培养基中，置温度为37℃、饱和相对湿度为0.05%的CO2孵箱中培养。在细胞数达1×109个/L前用完全培养基重新悬浮，并以1∶3细胞数的比例传代，取对数生长期的细胞进行后续试验。

供试品溶液制备：取半边旗、剑叶凤尾蕨、刺齿凤尾蕨、蜈蚣草、井栏边草各2 g，剪碎，过80目筛，制成粗粉，分别置索氏提取器中，加入95%乙醇适量，回流提取6 h，提取液用甲醇定容至50 mL容量瓶中；并以6 000 r/min的速率离心15 min，分别准确量取10 mL，50℃水浴至甲醇蒸干，加入二甲基亚砜，配制成质量浓度分别为0.5，1.0，2.0，4.0 g/L的系列供试品溶液。

细胞生长抑制试验：取对数生长期的HL−60细胞和K562细胞，用完全培养基稀释至（1.0～2.0）×108个/L，分别装入24孔培养板，每孔1 mL，每孔细胞分别加入1 µL不同质量浓度的供试品溶液，另吸取1µL二甲基亚砜作为对照（供试品质量浓度为0 g/L），做3～6个平行孔，将细胞置温度为37℃、饱和相对湿度为0.05%的CO2孵箱中培养24 h，分别取出，用台盼蓝染色，3 min内用计数板统计活细胞数和死细胞数，采用37XB型倒置生物显微镜观察，死细胞显淡蓝色；活细胞拒染，颜色无明显变化。以公式［细胞存活率（%）=活细胞数/细胞总数×100%］计算细胞活存率。

1.3 统计学处理

采用SPSS 21.0统计学软件分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对K562细胞生长的抑制

由表1可知，5种凤尾蕨属植物对K562细胞的生长均有抑制作用；半边旗对K562细胞生长的抑制作用最强，其次为蜈蚣草。

表1 5种凤尾蕨属植物对K562细胞生长的抑制作用比较Tab.1 Comparison of inhibitory effects of five Pteris plants on the growth of K562 cells

2.2 对HL-60细胞生长的抑制

由表2可知，5种凤尾蕨属植物对HL−60细胞的生长均有抑制作用；半边旗和刺齿凤尾蕨对HL−60细胞生长的抑制作用较强，试验浓度范围内两者的作用差异不显著，而剑叶凤尾蕨和蜈蚣草的抑制作用较弱。

表2 5种凤尾蕨属植物对HL-60细胞生长的抑制作用比较Tab.2 Comparison of inhibitory effects of five Pteris plants on the growth of HL-60 cells

3 讨论

半边旗中二萜类有效成分pteisolic acid G（PAG）可提高Bax/Bcl−2基因和蛋白质的比值，从而诱导肝癌细胞HepG2凋亡［4］；5F（11α−羟基−15−氧−16−烯−贝壳杉烷−19−酸）可有效减少酵母多糖诱导的腹膜炎小鼠血清中一氧化氮、肿瘤坏死因子−α、白细胞介素6、白细胞介素10、单核细胞趋化蛋白1的含量，从而减轻炎性反应［5］。半边旗主要通过抑制肿瘤细胞的DNA与RNA和蛋白质合成［6−7］，阻断肿瘤细胞的细胞周期［8］，起到杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞生长的作用。

药用植物亲缘学研究结果表明，亲缘关系近的植物含有结构相似的化学成分，结构相似化学成分的生理活性多相似［9］，根据该原理从凤尾蕨属其他种类植物中寻找具有更强抗肿瘤活性的对映贝壳杉烷型二萜类药物。本研究结果表明，与半边旗同属的凤尾蕨属植物剑叶凤尾蕨、刺齿凤尾蕨、蜈蚣草和井栏边草也具有抗白血病作用，但半边旗和刺齿凤尾蕨对HL−60细胞的抑制作用较强，4.0 g/L半边旗和刺齿凤尾蕨乙醇提取物中，HL−60细胞的存活率均为0；半边旗和蜈蚣草对K562细胞的抑制作用较强，4.0 g/L半边旗和蜈蚣草乙醇提取物中，K562细胞的存活率分别为0和7.70%。

综上所述，5种凤尾蕨属植物均可抑制HL−60细胞和K562细胞的生长，但对HL−60细胞的生长抑制作用强于K562细胞；除半边旗外，刺齿凤尾蕨和蜈蚣草可能是潜在的抗白血病药物。