EGCG对三硝基苯磺酸诱导的结肠炎小鼠肠道炎症和肠屏障功能的保护性作用和机制

葛思堂，张小凤，何逸凡，吴华涛，张紫凝，李 静,4，耿志军，宋 雪，左芦根

克罗恩病(Crohn′s disease，CD)是一种主要累及肠道的慢性、复发性疾病。既往CD主要见于欧美白人，但近10余年来该病在包括我国在内的亚洲地区呈现发病率逐年攀升的趋势[1]。由于CD具有终身复发倾向，病人需要接受长期药物治疗以将肠道炎症控制在一个较低水平。现有的CD治疗药物包括糖皮质激素、免疫抑制剂(硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤等)和生物制剂等，但这些药物均存在程度不等的耐药、药物抵抗和不良反应等，因而新的低毒、不良反应小、疗效确切的药物亟待被开发[2]。虽然CD的发病机制尚不明确，但肠上皮细胞结构和功能缺陷导致的肠屏障功能障碍是引发或维持肠道慢性炎症的重要途径之一[3]。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是绿茶中分离提取出的一种儿茶素类单体化合物，具有上皮细胞保护、抗炎等多种生物学活性[4-5]。但EGCG在CD疾病中的抗炎、肠上皮细胞保护作用并未得到充分研究。本研究分析EGCG干预对结肠炎小鼠肠道炎症和肠屏障的作用效果，以期为CD的临床药物治疗选择提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 动物模型和分组 选取24只体质量22～25 g的6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠。饲养于无特定病原体环境中，光照和黑暗12 h循环一次，环境温度20～24 ℃，给予普通饲料喂养，自由饮水。将小鼠随机分为模型组(Model组)、对照组(WT组)和EGCG干预组(EGCG组)。Model组和EGCG组接受2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)(Sigma，USA)干预构建结肠炎模型。模型制备方法：小鼠7 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，取头低脚高位，经肛门置入灌胃针(2 mm)，向结肠内注射0.1 mL TNBS 0.9%氯化钠溶液-乙醇溶液(1∶1)，每只小鼠TNBS剂量为150 mg/kg，保持体位30 min；7 d后，小鼠将形成稳定的CD样结肠炎[6]。对照组麻醉后，经肝门结肠腔内注射0.1 mL 0.9%氯化钠溶液。造模成功后，EGCG组给予腹腔注射15 mg·kg-1·d-1EGCG(Sigma，USA)治疗；Model组和WT组给予等量0.9%氯化钠溶液腹腔注射。干预4周后，处死小鼠，留取肠管、肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node，MLN)、肝脏、血清等标本，进行检测分析。

1.2 小鼠体质量和疾病活动度评估 小鼠体质量评估：每周测量小鼠体质量，比较各组小鼠干预前和干预结束后体质量变化。肠炎临床疾病活动度评估：观察记录小鼠肠炎临床症状，并进行肠炎疾病活动度指数(disease activity index，DAI)评分，包括毛发竖立(1分)、血便(1分)、稀便(1分)、直肠脱垂(1分)，严重腹泻和不能还纳的直肠脱垂各另计1分[7]。

1.3 结肠炎症组织学和分子学评估 结肠炎症组织学评分：取结肠组织常规石蜡包埋，采用HE染色后，依据SPENCER等[8]推荐的结肠炎症评分标准对小鼠结肠进行炎症评分：在200倍光镜下，取5个不重复视野分别评分，取平均值作为单张切片的结肠炎症评分结果。结肠黏膜炎症介质水平评估：取小肠结肠黏膜组织，充分研磨离心取上清液后采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunoabsorbent assay，ELISA)检测白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)水平，ELISA试剂盒购于Santa Cruz公司(USA)，依据产品说明书进行操作。

1.4 免疫荧光法分析小鼠结肠上皮紧密连接蛋白表达 结肠组织固定后经常规石蜡包埋，制作5 μm切片，经63 ℃烤片、脱蜡、抗原修复和5%山羊血清封闭后，滴加一抗稀释液ZO-1(1∶100,Abcam，USA)、Occludin(1∶100,Abcam，USA)，置于4 ℃孵育过夜；滴加荧光标记的二抗稀释液(1∶100)，室温孵育1 h，DAPI细胞核染色；荧光显微镜下观察紧密连接蛋白表达及分布。

1.5 Western blotting检测结肠Occludin、ZO-1、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的蛋白水平 取新鲜结肠黏膜组织，充分研磨，提取细胞蛋白，Bradford法定量；煮沸变性，每孔加入35 μg蛋白后电泳、转膜、封闭。分别加入一抗稀释液ZO-1、Occludin、p-JAK2、p-STAT3和β-actin(1∶1 000，Abcam，USA)，4 ℃摇床孵育12 h；洗涤后，分别加山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)，室温孵育2 h；洗膜，滴加ECL显影液采集图片，采用Image J软件分析Occludin 和ZO-1相对积分光密度值(IOD值)。

1.6 在体肠通透性试验和肠道细菌移位评估肠屏障功能 在体肠通透性试验[9]：小鼠禁食4 h，给予FITC-dextran灌胃，相对分子质量为4 000(Sigma，USA)，剂量为600 mg/kg；4 h后取小鼠血清，分光光度计检测血清FITC-dextran水平。细菌移位检测[10]：处死小鼠后，无菌条件下取小鼠肝脏和MLN，组织充分研磨后取0.1 g接种于细菌培养基(Mac-Conkey′s agar，Sigma，USA)，培养24 h计算菌落数，每个培养皿超过100个菌落判定为细菌培养阳性；每只小鼠每种组织进行2份独立细菌培养，并计算细菌移位比例。

1.7 统计学方法 采用t检验、χ2检验、方差分析和q检验。

2 结果

2.1 EGCG改善TNBS结肠炎小鼠营养状况和肠炎症状 EGCG组小鼠体质量增长高于Model组(P<0.05)，与WT组相比差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。干预第3～4周，EGCG组小鼠肠炎DAI评分明显低于Model组(P<0.01)(见表2)。

2.2 EGCG改善TNBS结肠炎小鼠肠道炎症 EGCG组小鼠肠道炎症评分低于Model组小鼠(P<0.05)； EGCG组小鼠肠黏膜IL-6和TNF-α水平均低于Model组小鼠(P<0.05)，但均高于WT组小鼠(P<0.05)(见图1、表3)。

表1 小鼠体质量变化比较

表2 各时间点小鼠DAI评分比较分)

表3 小鼠肠炎指标比较

2.3 EGCG改善TNBS结肠炎小鼠肠上皮细胞紧密连接蛋白表达 EGCG组小鼠肠上皮紧密连接蛋白Occludin和ZO-1水平均高于Model组(P<0.05)，与WT组相比差异无统计学意义(P>0.05)(见图2～4、表4)。

2.4 EGCG改善TNBS结肠炎小鼠肠屏障功能 EGCG组小鼠血清FITC-dextran水平低于Model组(P<0.05)，但高于WT组(P<0.05)(见表5)。EGCG组小鼠肝脏和MLN细菌移位率均低于Model组(P<0.05)，与WT组相比差异无统计学意义(P>0.05)(见表6)。

2.5 EGCG抑制TNBS结肠炎小鼠JAK2/STAT3信号 EGCG组小鼠肠黏膜组织p-JAK2和p-STAT3水平均低于Model组(P<0.05)，与WT组相比差异无统计学意义(P>0.05)(见图5、表7)。

表4 小鼠结肠黏膜紧密连接蛋白表达比较

表5 小鼠血清FITC-dextran水平比较

表6 小鼠细菌移位率比较[n；百分率(%)]

3 讨论

CD是一种尚无法治愈的炎症性肠病，反复发作的肠道炎症可导致肠道穿孔、狭窄等外科并发症，病人可因反复外科手术而导致短肠综合征，因而该病具有致残性[11]。由于手术仍然无法治愈CD，故病人需要终身接受药物治疗以维持疾病缓解。在疾病发病机制尚不明确的情况下，CD的临床治疗药物主要以免疫抑制和拮抗炎症为主[12]，虽然具有一定疗效但存在不良反应过重、药物抵抗以及不耐受等现象[13]。近年来，从天然植物中提取有效成分用于感染性、炎症性疾病的治疗成为研究前沿和热点。特别是青蒿素用于疟疾治疗所取得的重大成就，促使更多的学者尝试发掘植物提取物的药用价值。绿茶作为一种健康饮品，在中国具有悠久的饮用历史，其安全性已经得到充分的验证。EGCG是一种从绿茶中提取的儿茶素类单体化合物，作为一种小分子物质，具有无免疫源性、无毒和易吸收等特点；研究[14-15]显示其还具有抗炎和细胞保护等多种生物学功能。本研究采用TNBS诱导的结肠炎小鼠作为CD的动物模型，采用EGCG干预并发现其肠炎和肠屏障保护作用。

表7 小鼠结肠黏膜p-JAK2、p-STAT3蛋白水平比较

营养不良是CD常见的并发症，而TNBS诱导的小鼠肠炎进展过程也因摄食减少、腹泻等而表现为体质量降低或不增[16-17]。本研究发现为期4周的EGCG干预可以显著改善TNBS结肠炎小鼠的体质量。同时，采用DAI评分评估小鼠结肠炎临床症状发现，自EGCG干预的第3周起小鼠结肠炎症状趋于缓解，并维持到干预的第4周。这一组数据提示EGCG在体干预可以显著缓解小鼠CD样肠炎症状。我们进一步采用病理组织学比较各组小鼠结肠组织炎症情况，结果显示EGCG干预可显著改善TNBS小鼠结肠炎症评分；同时，EGCG组小鼠结肠黏膜组织内IL-6和TNF-α水平亦低于Model组，故进一步在组织和分子学水平证实EGCG在体治疗可有效拮抗CD样肠道炎症。

CD病人存在肠屏障功能障碍，表现为肠道通透性增加，使得细菌、毒素等抗原类物质可通过受损肠屏障系统进入人体，并进而诱发局部和系统性炎症反应[18-19]。肠上皮细胞紧密连接蛋白是构成肠屏障的结构基础，本研究采用免疫荧光和Western blotting检测证实EGCG干预可以显著改善TNBS小鼠肠上皮细胞紧密连接蛋白(Occludin和ZO-1)的表达。TNBS诱导的结肠炎模型小鼠存在类似人类CD的肠屏障结构和功能障碍，本研究通过在体通透性试验和肝、MLN细菌移位实验均证实EGCG干预可显著改善TNBS小鼠肠屏障功能。因此，EGCG的肠上皮细胞屏障保护作用可能是其发挥肠炎保护性作用的途径之一。

以上数据显示，EGCG可显著抑制TNBS诱导的结肠炎小鼠肠黏膜IL-6和TNF-α水平，而CD病人同样存在肠黏膜组织IL-6和TNF-α等炎症介质水平升高的现象，且这些炎症介质直接参与肠屏障的损伤。新近研究显示，JAK2/STAT3信号在CD肠黏膜中过度激活，其参与包括IL-6和TNF-α在内的多种促炎介质的表达调控[20]。本研究采用Western blotting检测证实，EGCG干预可以显著抑制TNBS诱导的结肠炎小鼠肠黏膜JAK2/STAT3信号的激活。这提示EGCG在体干预对于CD样肠炎的保护性作用至少部分是通过对JAK2/STAT3信号的抑制作用实现的。

EGCG的抗炎作用是当前的研究热点。在过敏性鼻炎模型小鼠的研究中，EGCG被证实可以直接抑制促炎介质IL-6及IL-1 β的产生而发挥抗炎作用[21]。同时，EGCG可抑制糖尿病大鼠外周血IL-1 β、IL-6 及TNF-α的水平，从而发挥改善代谢的疗效[22]。此外，在脊髓损伤模型中，EGCG被证实可通过抑制NF-κB信号、IL-6及TNF-α的表达，同时提高IL-4水平表达，以及诱导巨噬细胞M2极化等多种途径发挥抗炎的保护性作用[23]。因此，EGCG在多种病理生理过程中的抗炎作用，都提示其潜在的临床药物开发价值。

综上，EGCG在体干预可以保护TNBS诱导的CD样肠道炎症，可能的作用途径包括肠屏障功能保护和抑制JAK2/STAT3炎症信号。