不同产地金银花的质量评价

任 蓓,郝 娟,娄迎昕,张福生(山西省检验检测中心药品检验技术研究所,太原 03000;山西大学中医药现代研究中心;通讯作者,E-mail:ample007@63.com)

金银花,为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或带初开的花。它是临床上常用的一味中药,有清热解毒、疏散风热之功效,主要用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等症[1],素有“中药中的青霉素”之称[2]。金银花的化学成分主要为有机酸类、黄酮类、挥发油类、三萜皂苷类、环烯醚萜类等[3,4],具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、保肝、调节免疫等药理作用[5]。金银花主产于我国河南、山东、河北等地,且以河南产“密银花”“封丘金银花”与山东产“济银花”为道地药材[6]。

现有文献报道关于金银花的质量评价中,使用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)对金银花单一指标成分(如绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、总黄酮等)的含量测定分析及指纹图谱的研究较多[7-10],但是系统地从性状、鉴别、一般检查、含量测定来综合分析金银花质量的未见报道。本文按照2015年版《中国药典》对不同产地的5批金银花饮片进行定性和定量分析,并将数据进行SPSS聚类分析,评价不同产地的金银花质量优劣,为金银花临床用药提供数据支持。

1 实验材料

1.1 实验仪器

XP205电子天平(梅特勒-托利多公司,瑞士)、MS204S电子天平(梅特勒-托利多公司,瑞士)、Auto imager D2正置微分干涉显微镜(蔡司,德国)、岛津LC-2030C 3D高效液相色谱仪(岛津,日本)、CEM Phoenix微波灰化系统(深圳市华盛昌科技实业股份有限公司,中国)、DHG-9070A电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司,中国)。

1.2 实验样品与试剂

1.2.1 实验样品 所有饮片均为抽样人员在市场上随机抽取样品,相关信息见表1。

表1 不同批次金银花相关信息

1.2.2 实验试剂 分析纯甲醇、磷酸、冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司);色谱纯乙腈(天津市四友精细化学品有限公司);优级纯盐酸(西陇科学股份有限公司);高效薄层层析硅胶板,HX69481821(默克);所用水为纯化水;由以上试剂配制成各项检查所需要的试剂。

1.2.3 对照品 对照品信息见表2。

表2 对照品信息

2 实验方法

2.1 性状鉴别

将表1中不同批次的金银花饮片,四分法后,取10 g样品进行性状鉴别。剩余药材粉碎后过2号筛(24目)和6号筛(100目),用于水分、灰分等的测定。

2.2 水分测定、总灰分和酸不溶性灰分测定

分别按照2015年版《中国药典》四部[11]通则0832水分测定法第四法、2302灰分测定法测定水分、总灰分和酸不溶性灰分含量。

2.3 显微鉴别

取过6号筛后的粉末少许,放置于载玻片上,水合氯醛透化后在显微镜下观察金银花的腺毛、非腺毛、花粉粒、柱头的表皮细胞、草酸钙簇晶等特征。

2.4 薄层鉴别

称取2号筛后的金银花0.2 g,加甲醇5 ml,放置12 h,滤过,取滤液作为供试品溶液。另取绿原酸对照品10 mg,加甲醇10 ml,作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验,吸取供试品溶液20 μl、对照品溶液10 μl,分别点于同一硅胶H薄层板上,以乙酸丁酯-甲酸-水(7 ∶2.5 ∶2.5)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。

2.5 含量测定

2.5.1 绿原酸含量测定 按照高效液相色谱法(通则0512)测定绿原酸含量。色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-0.4%磷酸溶液(13 ∶87)为流动相;检测波长为327 nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1 000。

对照品溶液的制备:精密称取绿原酸对照品10 mg,精密称定,加50%甲醇10 ml,再精密量取4 ml的上述溶液,置10 ml棕色量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀,即得(10 ℃以下保存)。供试品溶液的制备:取本品粉末(过四号筛)0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50 ml,称定质量,超声处理(功率250 W,频率35 kHz)30 min,放冷,再称定质量,用50%甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,精密量取续滤液5 ml,置25 ml棕色量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀,即得。然后分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl注入液相色谱仪,测定,即得。

本品按干燥品计算,含绿原酸(C16H18O9)不得少于1.5%。

2.5.2 木犀草苷含量测定 按照高效液相色谱法(通则0512)测定。色谱条件与系统适用性试验:用苯基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-phenyl 4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈为流动相A,以0.5%冰醋酸溶液为流动相B,按表3中的规定进行梯度洗脱;检测波长为350 nm。理论板数按木犀草苷峰计算应不低于20 000。

表3 流动相梯度洗脱比例

对照品溶液的制备:取木犀草苷对照品10 mg,精密称定,加70%乙醇10 ml,再精密量取4 ml的上述溶液,置10 ml称量瓶中,加70%乙醇至刻度,摇匀,即得。供试品溶液的制备:取本品粉末(过四号筛)2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%乙醇50 ml,称定质量,超声处理(功率250 W,频率35 kHz)1 h,放冷,再称定质量,用70%乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过。精密量取续滤液10 ml,回收溶剂至干,残渣用70%乙醇溶解,转移至5 ml量瓶中,加70%乙醇至刻度,即得。然后分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl,注入液相色谱仪,测定,即得。

本品按干燥品计算,含木犀草苷(C21H20O11)不得少于0.050%。

3 结果与分析

3.1 性状鉴别

每种中药材都有自己特定的颜色、气味,与其所含的化学成分相关,在长期用药实践中,一直把颜色和气味作为评价中药材质量的重要标准之一[12]。对上等药材的性状鉴别中,常常包括颜色和气味的语言描述,金银花以表面绿色[13,14],香气浓者,密被绒毛为佳。金银花叶茂盛,叶片表面有密集的短绒毛,手感柔软,而山银花叶片表面几乎没有绒毛或者绒毛粗糙,摸起来不柔软相对较硬[15]。金银花颜色由深到浅的文字描述定为:绿色-黄绿色-绿白色-黄白色-黄色,气味由浓到淡的文字描述定为:浓郁香气-气清香-气微。对不同产地的金银花进行性状鉴别,性状特征见图1,鉴别结果见表4。本次测定的5批金银花饮片,山东、河南产的金银花大小适中,黄绿色,绒毛覆盖率高;陕西和湖北产的金银花较为瘦小,颜色偏淡,绒毛稀疏;河北产的金银花体形较大,内空,气微。从性状鉴别结果可知,山东产的金银花性状大小适中,黄绿色,浓郁香气,密被绒毛,为道地药材标准。

图1 不同产地不同批次的金银花性状Figure 1 Characters of L. japonica from different producing areas

表4 不同产地金银花性状鉴别

3.2 水分测定、总灰分和酸不溶性灰分测定

水分含量符合药典限度12.0%,均在8.0%～9.0%之间。总灰分符合药典限度10.0%,变异系数为9.6%,小于15%,说明总灰分含量差异较小。湖北产金银花酸不溶性灰分较高,酸不溶性灰分均符合药典限度3.0%(见表5)。

表5 水分、总灰分和酸不溶性灰分含量测定结果 (n=3)

3.3 显微鉴别

显微镜下可见粉末浅黄棕色或黄绿色:非腺毛,单细胞,长而弯曲,壁薄,有微细疣状突起(见图2A);花粉粒类圆形,表面具细颗粒状雕纹(见图2B);腺毛较多,头部倒圆锥形,类圆形(见图2C);草酸钙簇晶(见图2D)。本次测定的5批样品中,都可以明显看到显微鉴别特征,符合药典标准。

图2 金银花显微特征 (×400)Figure 2 Microscopic characteristics of L. japonica (×400)

3.4 薄层鉴别

本次测定的5批中药饮片,均具绿原酸对照品特征斑点,斑点明显,从薄层色谱鉴别来看产地不同的金银花之间无明显差异。以河北产的金银花和山东产的金银花样品薄层色谱图为例(见图3)。

3.5 含量测定

3.5.1 绿原酸含量测定 5批饮片分别称取两份样品进行含量测定,求得每批饮片中绿原酸含量测定平均值,结果显示,本次测定的5批中药饮片,山东产的金银花绿原酸含量最高,其次为河北、河南、陕西的金银花,湖北的金银花中绿原酸含量最低,5批样品均高于药典限度1.5%(见表6)。

3.5.2 木犀草苷含量测定 5批饮片分别称取两份样品进行含量测定,求得每批饮片中木犀草苷含量测定平均值,结果显示,本次测定的5批中药饮片,其木犀草苷含量的变异系数为8.5%,小于15%,含量差异较小(见表7)。均达到药典限度,不少于0.050%。

1.河北产地20 μl;2.绿原酸对照品10 μl;3.山东产地20 μl;4.绿原酸对照品20 μl图3 金银花薄层鉴别Figure 3 TLC identification of L. japonica

表6 不同批号不同产地的金银花绿原酸含量

以样品编号为横坐标,以2个指标成分的含量为纵坐标作柱状堆积图,结果显示,2个指标成分的含量之和由高到低的排序为山东、河北、河南、陕西、湖北,排序与绿原酸含量的排序几乎接近(见图4)。

表7 不同批号不同产地的金银花木犀草苷含量

图4 金银花含量检测柱状堆积图Figure 4 Columnar packing diagram of content detection of L. japonica

3.5.3 含量测定聚类分析结果 采用平方欧式距离对5批金银花含量测定的木犀草苷与金银花的值进行聚类,结果见图5。5批金银花可以分为两大类,其中山东产的为一类,其他地方生产的为一类,说明山东产的金银花与其他产地的不同,结合含量测定数值分析,山东产的金银花质量较好。

图5 金银花含量测定的聚类分析Figure 5 Cluster analysis of content determination of L. japonica

4 讨论

金银花是临床上常用的一味中药,素有“中药中的青霉素”之称,在北方许多地区金银花也作为夏季茶饮的材料之一。金银花种类较多,质量各异,加之不同的生长地区、采集时间、加工方法对其成分的组成和含量均有影响。因此,科学可靠的质量评价对于金银花的质量控制至关重要。我国的药典标准近10年来一直在不断的完善发展中,使中药饮片的安全有更好的保障,本次实验检查方法为2015年版《中国药典》收录规定的检查方法。

金银花以表面绿色,香气浓者,密被绒毛为佳。实验结果表明,山东、河南产的金银花大小适中,色泽较深,绒毛覆盖率高;陕西和湖北产的金银花较为瘦小,颜色偏淡,绒毛稀疏;河北产的金银花体形较大,内空。从性状鉴别结果可知,山东产的金银花性状大小适中,黄绿色,浓郁香气,密被绒毛,为道地药材标准。

不同产地金银花一般质量检查结果无明显差异。显微和薄层鉴别结果均表明5批金银花合格。含量测定中,山东产的金银花绿原酸含量最高,不同产地的金银花中木犀草苷含量之间无显著差异。聚类分析表明,山东产的金银花为一类,其他产地的为另一类。总体而言,药典中对金银花绿原酸含量的限度较低,建议提高药典标准。山东产的金银花为道地药材,可以作为金银花饮片供应地。