荞麦花叶芦丁对高糖诱导的人晶状体上皮细胞损伤的影响

公丕媛 张雪 施小哲

(1吉林大学校医院，吉林 长春 130021；2吉林省中医药科学院第一临床医院；3长春中医药大学附属医院)

糖尿病性白内障是常见的一种糖尿病并发症，随着糖尿病发病率的升高，我国糖尿病性白内障的发病率呈增长趋势，体内持续高糖可加速糖尿病性白内障的恶化，甚至失明，人晶状体上皮细胞是糖尿病性白内障的重要靶细胞，高糖作用下可促使多元醇在晶状体内沉积而促使晶状体渗透压升高，进而导致晶状体水肿直至形成白内障，目前中草药的提取物或活性成分具有抗炎、抗氧化应激等作用，并可抑制糖尿病性白内障的进展，还可能减轻高糖诱导的人晶状体上皮细胞损伤〔1～3〕。荞麦黄酮是荞麦的主要提取物之一，其对糖尿病及其并发症具有良好的预防与治疗的作用，研究发现荞麦花叶芦丁是荞麦黄酮的主要成分，荞麦花叶芦丁具有降糖、降脂与抗氧化等作用，还可减轻2型糖尿病大鼠肝脏损伤〔4〕。但荞麦花叶芦丁与糖尿病性白内障的相关报道尚少。长链非编码RNA(LncRNA)在多种疾病形成及发展过程中可发挥重要调控作用，LncRNA FENDRR在高糖诱导的人视网膜内皮细胞中表达水平升高，并可促进高糖诱导的人视网膜内皮细胞的增殖和血管生成〔5〕。生物信息学分析显示FENDRR与miR-146b-3p存在结合位点，研究表明miR-146b-3p可抑制高糖诱导的视网膜炎症反应〔6〕。但FENDRR/miR-146b-3p分子轴是否可作为荞麦花叶芦丁预防与治疗糖尿病性白内障的潜在靶点尚未可知。因此，本研究采用高糖诱导人晶状体上皮细胞建立细胞损伤模型，探讨荞麦花叶芦丁是否可通过调控FENDRR/miR-146b-3p分子轴而减缓糖尿病性白内障的发展进程。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 荞麦花叶购自内蒙古通辽市库仑旗；人晶状体上皮细胞购自上海中乔新舟生物；DMEM培养液与胎牛血清购自美国Gibco；Trizol试剂购自美国Invitrogen；Lipofectamine2000、凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝；逆转录与荧光定量检测试剂盒购自美国Thermo Fisher；miR-NC、miR-146b-3p mimics、si-NC、si-FENDRR、anti-miR-NC、anti-miR-146b-3p购自广州锐博生物；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；兔抗人B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体购自美国CST；二抗购自武汉博士德生物。

1.2方法

1.2.1实验分组 荞麦花叶芦丁制备〔7〕：取荞麦花叶加水加热提取2次，收集滤液浓缩后加入酸性壳聚糖，过滤，收集滤液静置沉淀，得到黄色沉淀物(总黄酮含量95%)，总黄酮中加入95%乙醇后置于70℃水中加热溶解，过滤，收集滤液减压回收乙醇，干燥后得到荞麦花叶芦丁(含量98%)，加入培养基稀释至实验所需浓度0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L。人晶状体上皮细胞接种于含有浓度为30 mmol/L葡萄糖的培养液中培养24 h〔8〕，记为Model组。同时将正常培养的人晶状体上皮细胞记为Con组。人晶状体上皮细胞分别加入含有不同浓度(0.2、0.4、0.8 mg/L)荞麦花叶芦丁的培养基与含有30 mmol/L葡萄糖的培养液中培养24 h，分别记为Model+荞麦花叶芦丁低剂量组、Model+荞麦花叶芦丁中剂量组、Model+荞麦花叶芦丁高剂量组。si-NC、si-FENDRR、miR-NC、miR-146b-3p mimics分别转染入人晶状体上皮细胞后加入含有浓度为30 mmol/L葡萄糖的培养液中培养24 h，分别记为Model+si-NC组、Model+si-FENDRR组、Model+miR-NC组、Model+miR-146b-3p组。anti-miR-NC、anti-miR-146b-3p分别转染入人晶状体上皮细胞后加入含有浓度为0.8 mg/L荞麦花叶芦丁与30 mmol/L葡萄糖的培养液中培养24 h，分别记为Model+荞麦花叶芦丁+anti-miR-NC组、Model+荞麦花叶芦丁+anti-miR-146b-3p组。

1.2.2流式细胞术检测细胞凋亡率 按照上述分组处理人晶状体上皮细胞，加入预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，弃上清后将500 μl结合缓冲液加入细胞沉淀后，按照凋亡试剂盒分别加入膜联蛋白(Annexin)V-FITC与碘化丙啶(PI)，室温振荡孵育10 min后应用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.3检测氧化应激指标SOD、MDA的水平 用反复冻融法裂解各组人晶状体上皮细胞后，根据试剂盒说明书分别检测SOD、MDA的水平。

1.2.4qRT-PCR检测FENDRR和miR-146b-3p的表达水平 取各组人晶状体上皮细胞加入Trizol试剂提取RNA，检测RNA浓度，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，qRT-PCR过程中以cDNA为模板，反应体系：10×PCR缓冲液2.5 μl，硫酸镁(MgSO4)2.5 μl，脱氧核苷三磷酸(dNTPs)2.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，RNase-Free双蒸水(ddH2O)补足体系至25 μl，反应程序按照试剂盒说明书设置，应用罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪检测FENDRR(内参GAPDH)和miR-146b-3p(内参U6)的表达水平。

1.2.5双荧光素酶报告基因检测FENDRR和miR-146b-3p的靶向关系 用FENDRR和miR-146b-3p的结合位点克隆至pmirGLO载体得到野生型载体WT-FENDRR，用基因突变技术突变结合位点后将其克隆至pmirGLO载体得到突变型载体MUT-FENDRR，miR-NC、miR-146b-3p mimics与WT-FENDRR、MUT-FENDRR分别对人晶状体上皮细胞进行共转染24 h，收集细胞后检测其荧光素酶活性。

1.2.6Western印迹检测Bax、Bcl-2蛋白表达 按照“1.2.1”实验分组处理细胞后用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，根据BCA试剂盒检测蛋白浓度后变性(100℃水浴10 min)，按照每孔30 μg蛋白上样量进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，4℃孵育Bax(1∶800)、Bcl-2(1∶800)与内参GAPDH一抗稀释液(1∶1 000)过夜，TBST洗涤，室温孵育二抗稀释液(1∶2 000)1 h，电化学发光(ECL)显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1荞麦花叶芦丁对高糖条件下人晶状体上皮细胞凋亡的影响 与Con组比较，Model组细胞凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；与Model组比较，Model+荞麦花叶芦丁低剂量组、Model+荞麦花叶芦丁中剂量组、Model+荞麦花叶芦丁高剂量组细胞凋亡率降低(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，且不同剂量组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表1、图2。

图1 荞麦花叶芦丁对人晶状体上皮细胞凋亡的影响

表1 荞麦花叶芦丁减弱高糖条件下人晶状体上皮细胞凋亡、细胞氧化应激、FENDRR和miR-146b-3p表达

1～5：Con组,Model组,Model+荞麦花叶芦丁低剂量组，Model+荞麦花叶芦丁中剂量组,Model+荞麦花叶芦丁高剂量组

2.2荞麦花叶芦丁对高糖条件下人晶状体上皮细胞氧化应激的影响 与Con组比较，Model组SOD的活性降低(P<0.05)，MDA的水平升高(P<0.05)；与Model组比较，Model+荞麦花叶芦丁低剂量组、Model+荞麦花叶芦丁中剂量组、Model+荞麦花叶芦丁高剂量组SOD的活性升高(P<0.05)，MDA的水平降低(P<0.05)，且不同剂量组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.3荞麦花叶芦丁对高糖条件下人晶状体上皮细胞中FENDRR和miR-146b-3p的影响 与Con组比较，Model组FENDRR的表达水平升高(P<0.05)，miR-146b-3p的表达水平降低(P<0.05)；与Model组比较，Model+荞麦花叶芦丁低剂量组、Model+荞麦花叶芦丁中剂量组、Model+荞麦花叶芦丁高剂量组FENDRR的表达水平降低(P<0.05)，miR-146b-3p的表达水平升高(P<0.05)，且不同剂量组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.4FENDRR靶向miR-146b-3p LncBase Predicted v.2预测显示FENDRR与miR-146b-3p存在结合位点，见图3。共转染miR-146b-3p mimics，与共转染miR-NC相比较，野生型载体WT-FENDRR的荧光素酶活性降低(P<0.05)；与共转染miR-NC相比较，共转染miR-146b-3p mimics对突变型载体MUT-FENDRR的荧光素酶活性无明显影响，见表2。

图3 FENDRR和miR-146b-3p的互补序列

表2 双荧光素酶报告实验

2.5干扰FENDRR对高糖条件下人晶状体上皮细胞凋亡氧化应激的影响 与Model组、Model+si-NC组比较，Model+si-FENDRR组细胞凋亡率明显降低，Bax蛋白水平明显降低，Bcl-2蛋白水平明显升高，miR-146b-3p表达水平明显升高，SOD活性明显升高，MDA水平明显降低(均P<0.05)，见图4、图5、表3。

表3 干扰FENDRR减弱高糖条件下人晶状体上皮细胞凋亡氧化应激

图4 干扰FENDRR对人晶状体上皮细胞凋亡的影响

1～3：Model组,Model+si-NC组,Model+si-FENDRR组

2.6miR-146b-3p对高糖条件下人晶状体上皮细胞凋亡氧化应激的影响 与Model组、Model+miR-NC组比较，Model+miR-146b-3p组细胞凋亡率明显降低，Bax蛋白水平明显降低，Bcl-2蛋白水平明显升高，SOD活性明显升高，MDA水平明显降低(均P<0.05)，见图6、图7、表4。

图6 miR-146b-3p对人晶状体上皮细胞凋亡的影响

1～3：Model组,Model+miR-NC组,Model+miR-146b-3p组

表4 miR-146b-3p减弱高糖条件下人晶状体上皮细胞凋亡氧化应激

2.7抑制miR-146b-3p可逆转荞麦花叶芦丁对高糖条件下人晶状体上皮细胞凋亡氧化应激的影响 与Model+荞麦花叶芦丁+anti-miR-NC组比较，Model+荞麦花叶芦丁+anti-miR-146b-3p组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，Bax蛋白水平明显升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平明显降低(P<0.05)，SOD活性明显降低(P<0.05)，MDA水平明显升高(P<0.05)，见表5、图8、图9。

表5 抑制miR-146b-3p可逆转荞麦花叶芦丁对高糖条件下人晶状体上皮细胞凋亡氧化应激的影响

图8 抑制miR-146b-3p可逆转荞麦花叶芦丁对人晶状体上皮细胞凋亡的影响

1～4：Model组,Model+荞麦花叶芦丁组，Model+荞麦花叶芦丁组,Model+荞麦花叶芦丁+anti-miR-NC组,Model+荞麦花叶芦+anti-miR-146b-3p组

3 讨 论

人晶状体上皮细胞可维持晶状体生长、分化等，当细胞内氧自由基生成量增多可造成细胞氧化损伤从而产生病理性变化，因而如何减轻高糖诱导的人晶状体上皮细胞损伤成为治疗的关键，既往研究显示葛根素等中药可抑制糖尿病性白内障的发展，但关于其作用机制仍需进一步验证〔9〕。已有研究证实LncRNA在高糖诱导的人晶状体上皮细胞损伤中表达异常，并可能作为减轻细胞损伤的潜在靶标〔10，11〕。

荞麦花叶芦丁可降低2型糖尿病大鼠血糖含量，还可保护大鼠肾脏组织〔12〕。荞麦花叶芦丁可清除氧自由基及抑制脂质过氧化进而减轻乙醇诱导的肝细胞损伤〔13〕。本研究结果显示，高糖诱导的人晶状体上皮细胞凋亡率与Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，与相关研究报道结果相似〔14〕，进一步研究发现随着荞麦花叶芦丁浓度的增高，高糖诱导的人晶状体上皮细胞凋亡率与Bax蛋白水平降低，而Bcl-2蛋白水平升高，提示荞麦花叶芦丁可抑制高糖诱导的人晶状体上皮细胞凋亡，且呈剂量依赖性。本研究结果显示，高糖诱导的人晶状体上皮细胞中SOD活性降低，而MDA水平升高，与研究报道结果相似〔15〕，用荞麦花叶芦丁处理后高糖诱导的人晶状体上皮细胞中SOD活性升高，MDA水平降低，提示荞麦花叶芦丁可抑制高糖诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激，且呈剂量依赖性。

本研究结果显示，高糖诱导的人晶状体上皮细胞中FENDRR的表达水平升高，而随着荞麦花叶芦丁使用剂量的增高，高糖诱导的人晶状体上皮细胞中FENDRR的表达水平降低，提示荞麦花叶芦丁可能通过下调FENDRR的表达而发挥作用。研究表明FENDRR通过调节miR-126促进脑微血管内皮细胞的凋亡〔16〕。但有研究发现FENDRR通过下调p53表达而抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡〔17〕。与以往研究不同，本研究证实FENDRR的表达水平升高可促进高糖诱导的人晶状体上皮细胞损伤，而干扰FENDRR表达后高糖诱导的人晶状体上皮细胞凋亡率降低，SOD活性升高，MDA水平降低，提示干扰FENDRR表达可减轻高糖诱导的人晶状体上皮细胞损伤。本研究进一步分析发现干扰FENDRR表达后miR-146b-3p的表达水平升高，而高糖诱导的人晶状体上皮细胞中miR-146b-3p的表达水平降低，荞麦花叶芦丁能够促使miR-146b-3p的表达水平升高，同时本研究证实FENDRR与miR-146b-3p之间确实存在靶向结合关系，且存在负向调控的作用。研究表明miR-146b-3p高表达可减轻制人视网膜血管内皮细胞损伤〔18〕。利拉鲁肽可能通过升高miR-146b-3p的表达而抑制高糖诱导的血管内皮细胞炎症反应〔19〕。miR-146b-3p的上调可通过抑制磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路而抑制急性呼吸窘迫综合征的发展〔20〕。提示荞麦花叶芦丁可能通过下调FENDRR的表达而上调miR-146b-3p的表达从而抑制糖尿病性白内障的发展。为进一步验证荞麦花叶芦丁是否通过调控FENDRR/miR-146b-3p分子轴而发挥作用，本研究结果显示，miR-146b-3p过表达后可明显降低高糖诱导的人晶状体上皮细胞凋亡率，还可增强其抗氧化能力，而抑制miR-146b-3p表达后可明显逆转荞麦花叶芦丁对高糖诱导的人晶状体上皮细胞凋亡及氧化应激的作用。进一步证实荞麦花叶芦丁可通过调控FENDRR/miR-146b-3p分子轴而减轻高糖诱导的人晶状体上皮细胞损伤。

综上所述，高糖诱导的人晶状体上皮细胞中FENDRR的表达水平升高，而miR-146b-3p的表达水平降低，荞麦花叶芦丁可下调FENDRR的表达而上调miR-146b-3p的表达，进而抑制高糖诱导的人晶状体上皮细胞凋亡及增强细胞抗氧化能力，FENDRR/miR-146b-3p可能作为荞麦花叶芦丁治疗糖尿病性白内障的潜在靶标，还可能作为进一步揭示糖尿病性白内障形成的分子机制。但仍需体内动物实验模型进一步验证荞麦花叶芦丁对糖尿病性白内障的作用，为临床试验及治疗糖尿病性白内障提供新方向。