长期饮酒致高血压伴肝损伤小鼠模型的建立

赵士博 吴忠港 张艺馨 谢开仁 于雪滢 郑淮远 潘智 黄锁义

(右江民族医学院 1基础医学院，广西 百色 533000；2科学实验中心；3广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室)

高血压是世界范围内的一个主要公共卫生问题〔1～3〕。高血压多由遗传因素引起，但其病因尚未明确〔4〕。有统计结果表明，长期饮酒人群患高血压的风险远大于普通人。长期饮酒造成高血压的同时，也为肝脏带来不同程度损伤。我国目前高血压发病率仍呈上升趋势，且高血压可引发心脑血管等疾病，严重影响人们的健康和生活质量〔5〕。高血压可导致的肌纤维化与心室僵硬，是严重的心血管危险因素〔5～7〕，肝有很高的再生潜能〔8〕，如何在临床治疗中对饮酒致高血压合并肝损伤进行更有效的治疗或早期预防十分重要。本研究选用普通级小鼠为实验动物，建立饮酒致高血压合并肝损伤的病变模型。以便于进一步研究饮酒致高血压合并肝损伤的发病机制、临床治疗方案及防治方法。

1 材料和方法

1.1实验仪器 OLYMPUS BX51透反两用研究系统显微镜〔奥林巴斯(中国)有限公司〕；Thermo ScientificTMHistoStarTM组织包埋机(赛默飞世尔科技中国有限公司)；全自动生化分析仪(日立7600-series)；YLS-1A多动能小鼠自主活动记录仪(山东省医学科学院设备站)；ALC-NIBP无创伤血压测量分析系统(上海奥尔科特生物科技有限公司)；ALC-HTP动物恒温系统(上海奥尔科特生物科技有限公司)；JSC电子天平秤CN-BH；JY0127-91条形盒测力计(规格：10 N)。

1.2实验试剂 牛栏山二锅头白酒62度5 L大桶装(产品编号：Q/SYSHN0014)；清洁级实验鼠维持饲料(江苏省协同医药生物工程有限责任公司出品)。

1.3实验方法与指标检测

1.3.1动物分组与饲养方法 实验动物：健康SPF级小鼠100只，雌雄各半，体重30～45 g/只，周龄不详，由右江民族医学院动物实验中心提供。方法：小鼠依性别分为20笼(每笼5只随机分组并标号)，24 h昼夜周期喂养。经标准饲料适应性喂养1 w后，取雌雄各5笼共50只为对照组，正常食水喂养。其余50均采用自由饮酒法(乙醇体积分数从5%逐渐递增至25%)建立饮酒型高血压模型小鼠。

1.3.2一般体征监测 每天定时测定小鼠食量，每3 d测小鼠体重一次。每周测定自主活动、抓力。每30 d测量血压即收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均脉压(MBP)，并记录数据。(1)食量：每天定时称量每笼小鼠食物总质量，除以每笼小鼠个数，得到24 h内每只小鼠食量。以周为单位计算每只小鼠周平均食量。(2)体重：每3 d称小鼠体重，统计每只小鼠的体重变化情况。(3)自主活动：采用多功能小鼠自主活动记录仪，将小鼠置于自主活动仪内预适应10 min后，记录10 min内小鼠活动次数，测定3次，取平均值。(4)抓力：采用弹簧测力计测定小鼠抓力，将小鼠置于铁网上，待小鼠用力抓住铁网时及时加力后拉，测到最大抓力，测定3次，取平均值。(5)血压：睡眠血压作为降低心血管疾病风险的治疗目标的作用尚不明确〔9〕，因此本研究选择测量小鼠清醒时期的血压。应用ALC-NIBP无创伤血压测量分析系统测定小鼠清醒时的血压，并固定血压测定的时间于下午三点进行，避免因不同时间所带来的干扰。测定血压之前先打开预热器加热，控制室温在25～30℃。检测各通道气密性，保证各通道正常工作。将小鼠装入鼠笼，调节鼠笼松紧度并置于恒温毯上预热10 min。恒温系统温度控制在40～45℃。将小鼠鼠尾穿过固定器孔固定好后，将脉搏传感器有感应面(圆形小胶块)的一面向上插入脉搏传感器插孔，推至底部以保证传感器位置正确，并在电脑中显示出均匀稳定的波动后即可开始测定血压。每30 d测定清醒状态下小鼠SBP、DBP、MBP值。

1.4肝脏组织病理切片观察 待小鼠SBP高于130 mmHg且保持稳定后于模型组中随机挑选4只小鼠颈椎脱臼处死，开腹取其肝脏组织，送至右江民族医学院附属医院病理科进行切片制作，请病理科医生进行查看并给予病理诊断。

1.5肝功能指标的测定 待小鼠SBP高于130 mmHg且病理切片明确反映肝损伤后，禁食12 h，眼球采血并分离血清，送至右江民族医学院附属医院检验科测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)的含量。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0软件进行配对样本t检验。

2 结 果

2.1食量 与对照组比较，模型组食量明显下降。随着饮酒周期与饮酒浓度的增加，食量变化幅度较大，且随着时间推移模型组24 h摄入量整体呈下降趋势。见表1。

2.2体重 与对照组比较，模型组体重波动较大，后期下降明显，与饮酒致食欲降低有关。见表1。

2.3自主活动 与对照组比较，模型组自主活动有明显幅度的下降。随饲养时间的增长，模型组自主活动整体呈下降趋势。见表1。

2.4抓力 随造模时间的增长，模型组出现乏力疲倦，随给酒浓度的上升，模型组逐渐出现下降趋势。见表1。

表1 两组造模不同时间食品、体重、自主活动、抓力比较

2.5血压 两组造模60 d、72 d SBP、DBP显著高于造模30 d(均P<0.01)。两组间造模60 d、72 d SBP、DBP比较均存在显著差异(均P<0.01)，且造模72 d差异更显著。见表2。由于血压范围明显超出正常值，提示高血压模型小鼠复制可能已经成功。

表2 两组SBP、DBP、MBP比较

2.6病理切片 自由饮酒喂养72 d，模型组肝脏出现肝细胞水肿，脂肪变性伴细胞坏死，间质少量淋巴细胞浸润，提示肝细胞出现轻微炎症。形态学检查提示模型组肝脏出现病理性改变。见图1。

图1 模型组病理切片形态学(HE染色)

2.7肝功能检测 模型组血清ALT和AST、ALP含量显著高于对照组(P<0.01)。两组ALB无统计学差异(P>0.05)。见表3。提示模型组小鼠出现肝损伤。

表3 两组肝功能指标

3 讨 论

高血压是引发心脏病和脑卒中的主要原因。其发病机制尚不清楚〔10，11〕。酒精性肝损伤初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化〔12〕。目前饮酒人群中高血压患病率高、危害大，过多的钠盐、低钾饮食、饮酒过度、饱和脂肪酸摄入过量致使血压升高，现今与高血压有关的疾病死亡率和发病率正在上升〔13，14〕。高血压作为世界上最常见的慢性病，长期饮酒在导致血压升高的同时也会诱发肝脏疾病〔15，16〕。

在中国北方和寒冷地区的人群盐摄入量高于南方和沿海地区，人群平均血压及高血压患病率也相应较高〔17〕。生活中高血压多以继发性为主，不良生活方式诱发为多。酒性湿热，过量饮酒导致湿热酒毒积累伤脾，湿热浊邪留于肝脏，日久湿聚成痰，痰浊、湿热与血相互搏结停于肋下而形成痞块、瘀停水阻，而大腹如鼓，发为“酒臌”。长期饮酒型高血压证候特征表现为“纳呆少食”“身重肿满”“体倦乏力”。过量饮酒致使酒精堆积伤及肝脏〔18〕。故从饮食角度研究并建立高血压动物模型，对高血压的预防和干预具有重要意义。

综上，长期饮酒致高血压可引起小鼠肝功能异常。单纯饮酒诱导后随着饮酒浓度的提升小鼠血压升高明显，持续、稳定的提升饮酒浓度可加速小鼠高血压造模，通过自由饮酒造模可得到稳定的高血压小鼠模型，为治疗饮酒致高血压并改善肝脏损伤的药物药效学评价奠定基础；为临床针对长期饮酒致高血压合并肝损伤病例的用药、治疗与深入研究提供思路。