老年胃癌患者循环肿瘤细胞与临床病理特征及化疗疗效的关系

李欣 赵久达 林明哲 王琼 魏文娥 包夏青

(青海大学附属医院 青海大学附属肿瘤医院，青海 西宁 810001)

胃癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤。流行病学研究显示〔1〕，我国每年胃癌新发病例数为67.9万，死亡49.8万例，均处于癌症发病率和死亡率的第二位。并且我国早期胃癌的发现率较低，大部分患者就诊时已处于进展期，需要以化疗为主的综合治疗，这在老年人群中体现的尤为明显。目前评估胃癌化疗疗效措施较少，大多依靠增强CT等影像学检查及癌胚抗原等血清肿瘤标记物，灵敏度及时效性均较差，因此有必要探索新的评价体系。循环肿瘤细胞(CTCs)是由肿瘤原发灶或转移灶脱落至血液循环中的肿瘤细胞，痕量存在于外周血中，能够反映肿瘤的实时状态，已被美国食品药品监督局(FDA)批准用于乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌的预后监测〔2〕。研究显示〔3〕，CTCs阳性在胃癌患者预后评估方面也具有重要价值。但目前甚少有关于CTCs分型与临床病理体征及化疗疗效的研究。鉴于此，本文开展了老年胃癌人群CTCs总数及分型意义的研究。

1 资料与方法

1.1研究对象 本研究经医院伦理委员会论证通过，患者或家属签署知情同意书后实施。选取2019年1月至2020年1月于青海大学附属医院肿瘤内科行化疗的进展期胃癌患者，依据纳入与排除标准，共60例患者纳入研究，其中男37例，女23例，年龄60～78岁。依据第8版美国癌症联合委员会(AJCC)分期标准，Ⅲ期38例(ⅢA 14例、ⅢB 16例，ⅢC 8例)，Ⅳ期22例。

1.2纳入标准 ①年龄≥60岁；②原发性胃癌，经组织活检或术后大体病理证实，且病理类型为腺癌；③入组前未接收过任何形式的放化疗、免疫治疗等；④人类表皮生长因子受体(Her)2未检测或不适宜行相关靶向治疗；⑤既往无恶性肿瘤病史，当前未合并其他部位原发肿瘤；⑥体力状况(PS)评分0～2；⑦外周血CTCs检查阳性。

1.3排除标准 ①临床资料或病理学资料不完整者；②合并风湿性疾病、自身免疫性疾病，或因其他原因长期口服免疫抑制剂者；③严重的心肝肾疾病，不能耐受化疗者；④因各种原因无法完成4个周期化疗，或未能完整收集到血标本者；⑤精神障碍患者。

1.4研究方法及检测指标 收集患者的临床病理学资料，包括性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、T分期、N分期、M分期、有无脉管侵犯等，患者均于化疗前1天采集空腹静脉血5 ml，检测CTCs总数及分型，分析临床病理特征与CTCs总数及分型间的关系。TNM分期参照第8版AJCC分期标准。患者均给予氟尿嘧啶+奥沙利铂为基础的化疗方案，21 d为1周期，每2个周期评价一次；分别于第2周期化疗结束后第20天、第4周期化疗结束后第20天(即第3、第5周期开始前1天)采集空腹静脉血5 ml，检测CTCs总数及分型；并在第4周期化疗结束后第20天时同时行影像学及肿瘤标志物的检查，依据实体瘤的疗效评价标准(RECIST1.1)，评估胃癌的化疗疗效，疗效标准分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、病情稳定(SD)和疾病进展(PD)。将PR+SD归入有效组，PD归入无效组。分析不同疗效间CTCs总数及分型间的差异。

1.5CTCs的鉴定 采用Canpatrol CTC系统进行鉴定：采集空腹静脉血5 ml置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，加入红细胞裂解液15 ml与其混合，作用30 min，500 r/min离心5 min，去除上清；含4%甲醛的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，固定8 min；将细胞悬液转移到含8 μm滤膜的过滤管中，0.08 MPa真空泵抽滤，将CTCs过滤到滤膜上；再次应用4%甲醛固定1 h。PBS洗涤滤膜3次后，将滤膜转移到24孔板中，蛋白酶 K预处理1 h；磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，加入CK8、CK18、CK19、上皮细胞黏附分子(Ep CAM)标记的上皮型RNA探针，vimentin 和 twist 标记的间质型生物探针及标记CD45的白细胞探针，孵育3 h；洗脱液洗涤3次，加入预扩增液和扩增探针，孵育30 min；洗脱液洗脱3次，再次与扩增液和探针孵育30 min；然后加入美国分子探针公司开发的系列荧光染料：Alexa Fluor 594(上皮)、Alexa Fluor 488(间质)、Alexa Fluor 750(白细胞)3种荧光标记探针，孵育30 min；0.1×柠檬酸钠缓冲液(SSC)缓冲液洗脱，加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色5 min。最后，应用自动荧光显微镜观察细胞，红色代表上皮型CTC(E+CTC)，绿色代表间质型CTC(M+CTC)，两者均表达代表混合型CTC(E+/M+CTC)，仅有白色代表白细胞。将M+CTC及E+/M+CTC统称为间质转化型CTC(EMT CTC)。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0软件进行随机样本t检验、单因素方差分析、配对样本t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1CTCs与临床病理特征 不同性别、年龄、肿瘤部位、分化程度、T分期及N分期患者CTCs总数和CTCs分型间的差异均无统计学意义(P>0.05)；存在远处转移(M1)及有脉管侵犯患者CTCs总数、M+CTCs、E+/M+CTCs及EMT CTCs均明显高于无远处转移(M0)、无脉管侵犯者(P<0.05)，而E+CTCs的差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 CTCs与临床病理特征间的关系

2.2CTCs与化疗疗效 60例患者中CR 0例，PR 19例，SD 12例，PD 29例，有效组和无效组化疗前CTCs总数及分型间的差异均无统计学意义(P>0.05)；有效组化疗2个周期及4个周期后，CTCs总数、M+CTCs、E+/M+CTCs及EMT CTCs均较治疗前明显降低(P<0.05)，且有效组均低于无效组(P<0.05)；有效组化疗4个周期后CTCs总数、E+/M+CTCs较2个周期后降低(P<0.05)；化疗前后E+CTCs的差异均未见统计学意义(P>0.05)；无效组化疗前后CTCs总数及分型间的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 CTCs与化疗疗效的关系

3 讨 论

研究显示〔4〕，我国胃癌的整体发病率呈下降趋势，但发病年龄出现后移趋势，目前平均发病年龄在60岁以上，且随着年龄的增长，胃癌的发病率也逐渐升高。加之老年人免疫功能下降，多合并其他系统疾病，对疾病及理化治疗的耐受性均下降，因此选择恰当的治疗方案，并及时早期评估疗效，对于老年胃癌的治疗显得更为紧要。

上皮间质转化(EMT)是肿瘤细胞实现远处转移的关键步骤〔5,6〕。实体瘤内的上皮型肿瘤细胞排列紧密、移动性差，不易出现远处转移，当其向间质型转化后，细胞形态和移动性发生改变，细胞可获得迁移、侵袭能力，进入血液循环，以游离的单个细胞或成簇的细胞团形式存在，即CTCs，最后到达远处脏器克隆增殖，发展成为肉眼可见的肿瘤病灶。

CTCs痕量存在于血液循环中，无法准确的定量检测是限制CTCs研究及应用的重要环节。以往的CellSearch系统过度依赖CTCs表达的Ep CAM等上皮标记物，会出现CTCs总数的不足，并且不能对CTCs进行分型。近年来，依据CTCs体积较大(>8 μm)和不表达CD45两点特性，发展了CanpatrolTM检测技术〔7〕。CanPatrolTM检测时先将血红细胞裂解去除，再通过特定孔径的过滤膜去除白细胞，最后利用含上皮与间质型标记物的探针进行荧光原位杂交技术(FISH)杂交，实现CTCs计数和分型鉴定。在本研究中，我们应用CanpatrolTM技术证实老年进展期胃癌患者血液循环中广泛存在CTCs(最多者达23个/5 ml血)，并对其分型进行了准确分类。

检测CTCs对于判断胃癌病情具有重要意义。Hong等〔8〕研究显示，CT或正电子发射计算机断层扫描(PET-CT)检查未发现远处转移的恶性肿瘤患者中，约20%患者可检测到CTCs，提示CTCs更有助于判断肿瘤的复发或转移。涉及26项研究、2 566例胃癌患者的meta分析显示〔9〕，Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者CTCs阳性率较Ⅰ～Ⅱ期明显升高。Cheng等〔10〕研究显示，CTCs与胃癌淋巴结转移、远处转移和ki-67水平相关，而与T分期和分化程度无关。严晓伟等〔11〕研究也显示，术前CTCs总数与胃癌N 分期有关，M+CTCs数量与TNM 分期和 N 分期相关。本研究提示发生了间质转换的CTCs容易造成脉管侵犯和远处转移，与上述研究具有相似之处，也符合肿瘤细胞的EMT及远处转移过程。

目前关于胃癌术后化疗存在着各个版本的共识意见及指南，但均缺乏及时有效的评估策略，在评估化疗方案的敏感性及早期有效性方面存在缺陷，检测化疗后CTCs可能对评估化疗方案具有一定作用。Liu等〔12〕检测了胃癌化疗前及化疗3个月后的CTC水平，显示化疗后CTCs总数降低患者获得了CR、PR或SD，而CTCs计数升高者出现了疾病进展，且CTCs总数降低者无进展生存期和总生存期更长。另一项对136例接受化疗的进展期胃癌患者的研究显示〔13〕，治疗6 w后不良CTC水平(≥3个CTCs/7.5 ml血)患者的总有效率和疾病控制率明显低于良好CTC水平组(<3个CTCs/7.5 ml血)(7.7% vs 30.0%、76.9% vs 95.0%)。Li等〔14〕研究发现，化疗有效患者CTCs总数及M+CTCs比例下降，而化疗后疾病进展者M+CTCs比例升高，但因例数减少，未进行统计分析。本研究提示血液循环中发生了间质转换的CTCs数目降低预示着化疗有效，这与化疗抑制了EMT有关，而早期检测CTCs总数及分型有助于评估化疗疗效。

不同于以往研究专注于CTCs总数或M+CTCs，本研究将E+/M+CTCs及EMT CTCs纳入研究，结果显示后两者与CTCs总数和M+CTCs整体趋势基本一致，但在部分情况下(如化疗4 w后)，E+/M+CTCs进一步下降提示化疗有效。这提示在将来的研究中，或许可以尝试将具有间质特性的循环肿瘤细胞作为一个整体进行研究。

综上所述，CTCs总数、M+CTCs、E+/M+CTCs及EMT CTCs与老年胃癌患者远处转移及脉管侵犯有关，且化疗有效组患者化疗后上述各指标均明显降低。