基于灰色关联分析法探讨黄精提取物抗氧化的谱效关系

赵秋华，潘乔丹，何柔柔，陆海峰，张忠伟，夏小燕

(右江民族医学院 药学院，广西 百色 533000)

黄精为百合科植物滇黄精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.、黄精PolygonatumsibiricumRed.或多花黄精PolygonatumcyrtonemaHua的干燥根茎[1]。研究发现，黄精药材中主要含有多糖[2]、甾体皂苷[3]、黄酮、蒽醌类化合物、氨基酸和微量元素等多种活性成分。现代药理研究表明，黄精具有抗氧化和抗衰老、改善学习记忆、降血糖、抗动脉粥样硬化等药理作用[4]。许多研究认为黄精多糖(PSP)是抗氧化、抗衰老的活性成分[5]，但是中药化学成分复杂，报道难以统一，也有研究认为黄精总皂苷亦有抗氧化、抗自由基的作用[6]。目前的很多研究是以中药化学成分谱和中药药效活性为切入点进行中药谱效关系的研究，这样可以更加全面地对中药质量进行评价，并为其药效物质基础研究提供新思路[7]。灰色关联度分析是研究事物之间、因素之间关联度的一种统计学方法。关联度定量描述了事物或因素之间关联性的大小，关联序反映了各指纹峰成分对药效的“贡献”大小顺序。对数据的要求较低，能分析小样本数据，在谱效关系研究中运用较为广泛[8]。因此，本实验采用不同溶剂提取黄精药材的不同部位，建立各部位的液相图谱，同时对不同提取部位的抗氧化活性进行评价；并采用灰色关联分析方法计算黄精指纹图谱特征峰(主要色谱峰)与抗氧化作用的关联度，最终确定其主要药效成分，为阐明黄精的抗氧化作用药效物质基础提供参考依据，现将研究过程报道如下。

1 实验材料

1.1 仪器

岛津LC-20A高效液相色谱仪，Inertsil ODS-3色谱柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；sartorius CPA64分析天平；HC-5002S数控型台式超声波清洗机；超纯水机。

1.2 药物与试剂

酒黄精药材(广西蓝正药业有限责任公司，批号为200302)；5-羟甲基糠醛(上海源叶生物科技有限公司，批号为B21832)；2，2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH，上海麦克林生化科技有限公司，批号为D807297)；色谱级乙腈(默克公司)；色谱级甲醇(默克公司)。其余试剂为分析纯，水为超纯水。

2 实验方法

2.1 黄精提取物的制备

将酒黄精粉碎为粗粉，称取8份，每份20 g，置锥形瓶中，分别加入160 mL不同溶剂(水、40%乙醇、60%乙醇、75%乙醇、90%乙醇、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯)，浸泡20 min，超声提取2次，每次30 min，抽滤，合并滤液，旋干为浸膏，备用。

2.2 黄精高效液相图谱的建立

2.2.1 色谱条件 岛津LC-20A高效液相色谱仪，Inertsil ODS-3色谱柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，以乙腈和水为流动相，采用二元梯度洗脱(梯度洗脱程序见表1)，流速1 mL/min，检测波长200 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.2.2 对照品溶液的制备 精确称取5-羟甲基糠醛对照品适量，加甲醇溶解配制成(0.4 mg/mL)的对照品溶液，0.22 μm滤膜滤过，按照色谱条件进样分析。

2.2.3 供试品溶液的制备 将8份黄精提取物样品加入甲醇溶解，制成黄精提取物10 mL(相当于原药材2 g/mL)，其中按照不同提取溶剂编号为S1(水)、S2(40%乙醇)、S3(60%乙醇)、S4(75%乙醇)、S5(90%乙醇)，S6(甲醇)、S7(正丁醇)、S8(乙酸乙酯)，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，按照色谱条件进样分析。

2.3 DPPH法测定黄精抗氧化作用

2.3.1 DPPH溶液的配制 称取DPPH适量，加甲醇配制成100μmol/L的溶液，避光保存。

2.3.2 黄精抗DPPH氧化活性的测定 按“2.1”项下方法提取黄精提取物，加60%甲醇倍比稀释成不同浓度供试品溶液。取供试品溶液与DPPH溶液各0.1 mL，置96孔板，混匀后室温避光放置30 min，在517 nm处测定吸光度Ai，同时测定供试品溶液0.1 mL+60%甲醇0.1 mLAj，60%甲醇0.1 mL+DPPH溶液0.1 mLA0，6个复孔，按以下公式计算清除率：

DPPH自由基清除率=(1-(Ai-Aj)/A0)×100%

清除率(Y)对药物浓度(X)进行对数线性回归，根据对数函数方程求出清除率为50%时的药物浓度。

2.4 统计学方法

采用Microsoft Office Excel 2003和SPSS AU在线统计分析平台，应用灰色关联分析法综合评价黄精提取物的抗氧化作用。

3 结果

3.1 HPLC色谱峰的归属

从8份黄精提取物(S1-S8)HPLC图谱中确定13个共有色谱峰(图1)。保留时间分别为：X1(7.708 min)，X2(10.125 min)，X3(15.037 min)，X4(19.839 min)，X5(20.194 min)，X6(21.055 min)，X7(21.698 min)，X8(23.524 min)，X9(29.239 min)，X10(38.116 min)，X11(47.418 min)，X12(50.804 min)，X13(68.421 min)。1号峰与5-羟甲基糠醛对照品的保留时间相同，因此鉴定为5-羟甲基糠醛。见图2。

图1 黄精不同溶剂提取物高效液相色谱

图2 5-羟甲基糠醛图谱

3.2 黄精提取物体外抗氧化作用分析

采用DPPH法测定黄精不同溶剂的抗氧化活性，结果显示，不同溶剂提取的黄精提取物均有一定的抗氧化作用，其中75%乙醇提取的黄精提取物抗氧化作用较强，清除率为50%时药物浓度为0.033 g/mL；正丁醇提取的黄精提取物抗氧化作用较差，清除率为50%时药物浓度为0.108 g/mL。以不同浓度乙醇为溶剂提取的黄精提取物之间抗氧化作用差异较小，结果见表2。

表2 黄精不同溶剂提取物抗氧化作用

3.3 黄精提取物HPLC图谱与抗氧化作用的灰色关联分析

3.3.1 灰色关联度分析 对获得的8份黄精药材HPLC指纹图谱共有峰的峰面积与清除DPPH自由基活性进行灰色关联度分析，研究两者的相关性。将不同溶剂提取的黄精药材清除DPPH自由基活性IC50设为参考序列(母序列)，13个共有峰峰面积设为比较序列(子序列)，将共有峰按顺序编为X1-X13，原始数据进行无量钢化处理(系统自动剔除2号峰数据)，按照文献方法及公式计算分析，求绝对差序列及关联系数，关联系数结果见表3。

表3 黄精抗氧化的谱效关系关联系数结果

3.3.2 谱效相关性分析 对黄精不同提取溶剂HPLC指纹图谱中各共有峰的峰面积与抗氧化活性进行灰色关联度及关联序分析。依据相对关联度的大小，确定了各成分对抗氧化作用贡献的大小顺序，分析黄精抗氧化作用的谱效关系。

结果显示，黄精抗氧化作用的药效是多种成分共同作用的结果，各特征峰所代表的化学成分对其抗氧化药效贡献的大小顺序，依次为：1号峰>9号峰>5号峰>8号峰>6号峰>11号峰>7号峰>4号峰>12号峰>10号峰>13号峰>3号峰，对抗氧化作用药效贡献大的前4 个峰分别为1、9、5、8号峰(见表4)；而1号峰经与对照品比对，鉴定为5-羟甲基糠醛，说明5-羟甲基糠醛的关联度最大。

表4 各色谱峰对抗氧化作用的贡献关联度分析结果

4 讨论

黄精生用刺激咽喉，经过炮制后可消除生品黄精的刺激性及副作用，同时化学成分发生改变，产生了5-羟甲基糠醛(5-HMF)。5-HMF是葡萄糖焦糖化反应和美拉德反应的典型产物之一。现阶段对于5-HMF探讨存在着很大的争论[9]，有报道称该化合物对人体横纹肌和内脏有毒副作用[10]，但近年来其生物活性受到了人们的广泛关注，有研究发现5-HMF具有抗氧化、改善学习记忆、抗过敏、保护神经细胞等对人体有益的作用[11]。这与本实验中5-羟甲基糠醛与黄精抗氧化作用关联度最大，结论一致。

建立现代化中药质量评价体系是一项系统工程，需要不断革新中药质量评价模式，形成以中药有效性为主体，活性物质为基础，多学科知识交互，多技术与方法共支撑的质量评价网络[12]。本实验对黄精不同溶剂提取物进行了HPLC分析，确定了13个共有色谱峰，采用灰色关联度分析法研究了共有色谱峰与抗氧化活性之间的谱效关系。发现各共有峰与黄精抗氧化活性均有不同程度的关联度，关联度在0.549～0.741之间，其中对抗氧化作用药效贡献大的前4 个峰分别为1、9、5、8号峰，目前已经鉴定1号峰为5-羟甲基糠醛，这也是关联度最大的化学成分，下一步可继续鉴定另外的3个化学成分，对贡献最大的4个化学成分进行定量分析及药效评价等研究，以期进一步明确黄精抗氧化作用的活性成分，为阐明黄精抗氧化作用的药效物质基础提供科学依据。