红枣山药蓝莓咀嚼片的研发及其免疫增强功能评价

杨兆艳，张 玲，田艳花，王玲丽

（1.山西药科职业学院食品工程系，山西 太原 030031；2.运城学院生命科学系，山西 运城 044000）

目前，机体免疫功能下降已成为危害现代人类健康的一大隐患，由于缺乏针对性的治疗措施，依靠日常饮食调理是提高人体免疫能力的最理想方法之一[1]。鉴于免疫功能低下人群的日益庞大，以及目前缺乏以传统食品为载体的免疫调节保健品，开发一款具有增强免疫力功效的保健食品具有较高的现实意义和推广价值。

红枣和山药都是集药、食、补三大功能于一体的保健佳品，具有健脾、养胃、益气的作用。红枣及红枣提取物对小鼠免疫功能的调节均有一定的作用[2-6]；山药多糖在一定程度上能够改善小鼠免疫功能[7-9]；蓝莓提取物在一定程度上能够增强小鼠免疫力[10]。目前，能充分突出红枣特色营养品质和依靠现代科学技术开发的深加工产品很少[11-13]，山药也主要为餐桌食品[14-16]。咀嚼片作为一种新型食品的形式，具有携带、食用、保存和运输方便等优点，且可以根据消费者不同的喜好和产品本身的要求制成形状各异、外表美观的片剂，增强消费者对产品的兴趣[17-21]。本试验以山西临县黄河滩枣和平遥长山药为研究对象，开发一款携带和食用方便的咀嚼片，通过动物受试试验评价其免疫调节活性，以期为红枣、山药、蓝莓的开发利用提供理论依据和试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

1.1.1.1 咀嚼片原辅料

红枣：山西临县黄河滩枣；山药：平遥长山药；蓝莓果粉：市售；木糖醇、微晶纤维素、柠檬酸，均为食品级。

1.1.1.2 试验动物

SPF级昆明种小鼠，雄性，4周龄左右，体质量18～22 g，小鼠饲养温度为20～26℃，相对湿度40%～60%，每天照明12 h，自由饮水，饲喂无菌全价营养颗粒饲料。

1.1.1.3 药品与试剂

绵羊红细胞（SRBC），北京博尔西科技有限公司；刀豆蛋白A（ConaA）、四甲基偶氮唑蓝（MTT），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；RPMI-1640培养液，赛默飞世尔科技公司；印度墨汁，南京都莱生物技术有限公司；YAC-1细胞，上海康朗生物科技有限公司；小牛血清，上海士峰生物科技有限公司；Hank’s液，上海恒远生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

405型电热恒温鼓风干燥箱，泰州金驰电力设备有限公司；AR224CN电子天平，奥豪斯仪器有限公司；DFY-300粉碎机，北京鑫骉腾达仪器设备有限公司；ZP01型单冲压片机，泰州市黎明制药机械有限公司；T9CS型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；HH-4恒温水浴锅，常州金坛良友仪器有限公司；TG16-WS离心机，湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司；LHH.CP-100 CO2细胞培养箱，上海印溪仪器仪表有限公司；NYW-MB96酶标仪，北京诺亚威仪器仪表有限公司；TA-XTC质构仪，上海保圣实业发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 红枣粉的制备

选取新鲜、无腐烂的红枣，切成6 mm薄片，于60℃烘箱中烘干16 h，干燥器内冷却，粉碎后过140目筛。

1.2.2.2 山药粉的制备

选取新鲜、无腐烂的山药，切成4 mm薄片，在复合护色剂中浸泡15 min，用清水冲洗干净后于60℃干燥箱中干燥8 h，干燥器内冷却，粉碎后过140目筛[16]。

1.2.2.3 制片

参照文献[17-20]的方法，结合产品自身特性，确定制片工艺为：向已配好的混合料中缓慢喷洒纯净水，搅拌均匀，制成具有一定软度的软料，软料要求捏成团，触之即散；软料制成后选用14目筛作为制粒工具，将软料过筛制成大小均匀的颗粒；将湿颗粒在50℃烘箱内干燥30 min至水分含量小于3%；过20目筛整粒，再使用80目筛去除细粉；在整粒后的颗粒中加入质量比为0.5%的硬脂酸镁，使用单冲压片机进行压片；压片后放入无菌室紫外线灭菌30 min，密封包装。

1.2.3 感官评价

产品感官评价由食品专业的老师和学生共计15人完成，评价标准见表1。

表1 咀嚼片感官评价表Table 1 Sensory evaluation table of chewable tablets

1.2.4 基础配方的确定

参照GB 2760—2014[21]规定的内容，结合前期预试验数据，以红枣、山药和蓝莓果粉为主料，辅以微晶纤维素、木糖醇和柠檬酸，得到基础配方为：红枣粉7 g，山药粉3 g，蓝莓果粉10 g，微晶纤维素4 g，木糖醇0.3 g，柠檬酸0.08 g。

文中蓝莓果粉、微晶纤维素、木糖醇、柠檬酸添加量以每10 g红枣山药粉为基准。

1.2.5 单因素试验设计

1.2.5.1 红枣粉、山药粉添加比例的筛选

以“1.2.4”的配方为基础，红枣粉与山药粉总添加量固定为10 g，配方中其他成分的添加量不变，考察红枣粉和山药粉质量比分别为1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1时对红枣山药蓝莓咀嚼片感官评价的影响，确定红枣粉和山药粉的添加比例。

1.2.5.2 蓝莓果粉添加量的筛选

以“1.2.4”的配方为基础，固定红枣粉和山药粉添加质量比为2.5∶1（总量为10 g），微晶纤维素添加量4 g，木糖醇添加量0.3 g，柠檬酸添加量0.08 g，考察蓝莓果粉添加量分别为8、9、10、11、12 g时对红枣山药蓝莓咀嚼片感官评价的影响，确定咀嚼片中蓝莓果粉的添加量。

1.2.5.3 微晶纤维素添加量的筛选

固定红枣粉和山药粉添加质量比为2.5∶1（总量为10 g），蓝莓果粉添加量10 g，木糖醇添加量0.3 g，柠檬酸添加量0.08 g，考察微晶纤维素添加量分别为2、3、4、5、6 g时对红枣山药蓝莓咀嚼片感官评价的影响，确定咀嚼片中微晶纤维素的添加量。

1.2.5.4 木糖醇添加量的筛选

固定红枣粉和山药粉添加质量比为2.5∶1（总量为10 g），蓝莓果粉添加量10 g，微晶纤维素添加量4 g，柠檬酸添加量0.08 g，考察木糖醇添加量分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g时对红枣山药蓝莓咀嚼片感官评价的影响，确定咀嚼片中木糖醇的添加量。

1.2.5.5 柠檬酸添加量的筛选

固定红枣粉和山药粉添加质量比为2.5∶1（总量为10 g），蓝莓果粉添加量10 g，微晶纤维素添加量4 g，木糖醇添加量0.3 g，考察柠檬酸添加量分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g时对红枣山药蓝莓咀嚼片感官评价的影响，确定咀嚼片中柠檬酸的添加量。

1.2.6 响应面优化试验设计

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计，以红枣粉和山药粉添加质量比（红枣山药粉总质量为10 g）及蓝莓果粉、微晶纤维素、木糖醇、柠檬酸添加量为自变量，以产品感官评分为响应值，设计5因素3水平的响应面分析试验，对红枣山药蓝莓咀嚼片的配方进行优化。响应面试验设计因素与水平见表2。

表2 响应面试验因素水平及编码Table 2 Factors and levels of response surface design

1.2.7 体内免疫调节试验

将160只小鼠适应性喂养1周后，随机分成对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组共4大组，每大组40只，组内再分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共4小组，每小组10只动物，具体试验项目分组为：Ⅰ组开展脏/体比值计算和碳廓清实验，Ⅱ组开展小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法）和NK细胞活性测定试验（LDH法），Ⅲ组开展迟发型变态反应试验（足跖增厚法），Ⅳ组开展抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）和血清溶血素测定（半数溶血值法）。咀嚼片按人体日推荐量（10 g/60 kg）的5倍（0.833 g/kg）、10倍（1.667 g/kg）、20倍（3.333 g/kg）设置小鼠低、中、高3个剂量组，分别取样品0.833、1.667、3.333 g，加蒸馏水至20 mL，按照20 mL/kg BW给予灌胃，每日1次，对照组给予相同体积的蒸馏水。连续灌胃30 d之后，参照《保健食品检验与评价技术规范》[22]中的方法测试各免疫指标。

1.2.8 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 红枣山药蓝莓咀嚼片中红枣粉与山药粉比例的确定

由表3可以看出，当红枣粉含量过低时，产品整体风味较差，有中药味，且产品黏合性不好，有裂缝；红枣粉含量过高时，产品口感粗糙，脱模粘连严重，原因可能是红枣粉中糖含量较高。因此，确定产品中红枣粉与山药粉添加质量比为2.5∶1。

表3 红枣粉与山药粉不同添加比例对红枣山药蓝莓咀嚼片感官品质的影响Table 3 Effect of different adding proportion of jujube powder and yam powder on the sensory quality of red dates,yam and blueberry chewable tablets

2.1.2 红枣山药蓝莓咀嚼片中蓝莓果粉添加量的确定

由表4可以看出，蓝莓果粉的添加量主要影响产品的风味，当蓝莓果粉添加量过低或过高时，产品整体风味都较差。因此，确定产品中蓝莓果粉的添加量为10 g。

表4 蓝莓果粉添加量对红枣山药蓝莓咀嚼片感官品质的影响Table 4 Effect of blueberry powder addition on the sensory quality of red dates,yam and blueberry chewable tablets

2.2 红枣山药蓝莓咀嚼片中微晶纤维素添加量的确定

由表5可以看出，微晶纤维素的添加量主要影响产品的硬度，当微晶纤维素添加量过低时，产品硬度差，易碎，过高时，产品硬度过高，咀嚼性差。因此，确定产品中微晶纤维素的添加量为4 g。

表5 微晶纤维素添加量对红枣山药蓝莓咀嚼片感官品质的影响Table 5 Effect of microcrystalline cellulose addition on the sensory quality of red dates,yam and blueberry chewable tablets

2.3 红枣山药蓝莓咀嚼片中木糖醇添加量的确定

由表6可以看出，木糖醇的添加量主要影响产品的甜度，当木糖醇添加量过低或过高时，产品整体风味都较差。因此，确定产品中木糖醇的添加量为0.3 g。

表6 木糖醇添加量对红枣山药蓝莓咀嚼片感官品质的影响Table 6 Effect of xylitol addition on the sensory quality of red dates,yam and blueberry chewable tablets

2.4 红枣山药蓝莓咀嚼片中柠檬酸添加量的确定

由表7可以看出，柠檬酸的添加量主要影响产品的酸度，当柠檬酸添加量过低或过高时，产品整体风味都较差。因此，确定产品中柠檬酸的添加量为0.08 g。

表7 柠檬酸添加量对红枣山药蓝莓咀嚼片感官品质的影响Table 7 Effect of citric acid addition on the sensory quality of red dates,yam and blueberry chewable tablets

2.5 响应面优化试验结果

2.5.1 响应面试验设计及结果

根据单因素试验确定的试验因素及水平，将红枣粉∶山药粉、蓝莓果粉、微晶纤维素、木糖醇和柠檬酸添加量为自变量，采用Box-Behnken试验设计五因素三水平的响应面分析试验，以感官评分为响应值，进行响应面分析，试验设计及结果见表8。

表8中46个试验点分为析因点和0点，其中析因点为自变量，取值在由-1，0，1构成的三维顶点，0点为区域的中心点，重复试验6次，用来估计试验误差。

表8 响应面中心组合试验设计与结果Table 8 Response surface central composite design and results

2.5.2 响应面试验结果回归分析

利用Design Expert软件，通过响应面回归方程分析数据，建立感官评分的回归模型，寻找其最优的反应条件。分析结果见表9和表10。

表10 模型可信度分析Table 10 Reliability analysis of model

如表9～10所示，回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），校正拟合度为0.980 6，表明该模型有较好地拟合性，该回归模型可用于预测分析且能较好地反映各因素与响应值之间的关系；变异系数值越小，表明试验的可靠性越高；模型预测拟合度值0.967 0与校正拟合度值0.980 6相近；信噪比一般大于或等于4即可取，试验信噪比为37.036，表明该模型可以用于指导试验设计，对实践具有指导意义。

2.5.3 交互作用分析

从图1和表9可知，对交互项AC、CD的显著性分析均为P＞0.05，交互作用不显著，AB交互作用显著（P＜0.05）、AD、AE、BC、BD、BE、CE、DE交互作用极显著（P＜0.01）。

图1 各因素交互作用对产品感官评分影响的响应面图Fig.1 Response surface plots of effects of interaction of various factors on the product sensory score

表9 回归模型方差分析表Table 9 ANOVA table of regression model

2.5.4 响应面最优条件的确定

根据参数分析得到产品感官评分编码的响应面二次回归模型为：

经分析，获得最优的试验条件和最优值为：红枣粉与山药粉质量比为2.46∶1（总质量为10 g），蓝莓果粉添加量9.92 g，微晶纤维素添加量3.81 g，木糖醇添加量0.32 g，柠檬酸添加量0.09 g，此条件下，预测产品的感官评分为46.83分。考虑实际操作的可操作性，将条件调整为红枣粉与山药粉质量比为2.5∶1（总质量为10 g），蓝莓果粉添加量10.00 g，微晶纤维素添加量3.80 g，木糖醇添加量0.30 g，柠檬酸添加量0.07 g，在此条件下生产产品并对其进行感官评价和硬度指标分析，感官评分为47分，与预测值接近，说明该优化参数可行，具有实际应用价值。以该优化配方制出的产品外观光整，组织坚实、不松散，剖面紧密、不粘连，酸甜适中，无异味，无粗糙感，硬度适中，宜咀嚼。

2.6 产品体内免疫调节试验结果

由表11可知，受试组小鼠增重与对照组比较无统计学差异；各剂量组小鼠胸腺指数和脾脏指数均极显著高于对照组（P＜0.01）。

表11 小鼠体质量和脏器指数测定结果Table 11 Measurement results of mouse body weight and organ index

由表12可知，与对照组比较，根据“OD差值”的数据可以看出，受试中、高剂量组都可以促进脾淋巴细胞的增殖，中剂量组差异显著（P＜0.05），高剂量组差异极显著（P＜0.01）；受试低剂量组足跖厚度略有增加，但无统计学差异，中、高剂量组小鼠足跖厚度极显著增加（P＜0.01）；受试低剂量组溶血空斑数显著增加（P＜0.05），中、高剂量组溶血空斑数极显著增加（P＜0.01）；受试低剂量组半数溶血值（HC50）略有升高，但无统计学差异，中、高剂量组小鼠HC50极显著升高（P＜0.01）；受试低剂量组碳廓清吞噬指数略有升高，但无统计学差异，中、高剂量组小鼠碳廓清吞噬指数极显著升高（P＜0.01）；受试低剂量组NK细胞活性略有增加，但无统计学差异，中、高剂量组都可以显著促进NK细胞活性的提高（P＜0.05）。

表12 小鼠淋巴细胞转化试验、迟发型变态反应试验、抗体生成细胞检测、血清溶血素检测、碳廓清实验、NK细胞活性测定结果Table 12 Results of mouse lymphocyte transformation test,late-type allergy test,antibody-producing cell test,serum hemolysin test,carbon clearance test,and NK cell activity measurement(±s,n=10)

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3 结论

（1）红枣山药蓝莓咀嚼片最优配方为：红枣粉与山药粉质量比为2.5∶1（总量为10 g），蓝莓果粉添加量为10 g，微晶纤维素添加量为3.8 g，木糖醇添加量为0.3 g，柠檬酸添加量为0.09 g并添加0.5%的硬脂酸镁。在此配方下生产的咀嚼片外观光整，组织坚实、不松散，剖面紧密、不粘连，酸甜适中，滋味醇厚，无异味，无粗糙感，硬度适中，宜咀嚼。

（2）根据《保健食品检验与评价技术规范》[22]增强免疫力功能判定原则：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性4个方面，任意2个方面结果阳性，可判定受试物具有增强免疫力功能。试验结果显示，咀嚼片可以有效延缓小鼠免疫器官的自然萎缩，提高小鼠体液免疫和细胞免疫，增强小鼠NK细胞活性，据此判定该咀嚼片具有增强免疫力的功能。

该研究为红枣、山药和蓝莓的深加工及以传统食品形态为载体的免疫调节保健品的开发提供了新的途径和方法。