宿主不同对丛枝菌根真菌扩繁效应的影响

马俊卿，侯 宁，孙晨瑜，杨怡森，覃圣峰，王 勇，刘 璐，廖虹霖，黄京华,3

（1广西大学农学院，南宁 530004；2广西高校作物栽培学与耕作学重点实验室，南宁 530004；3广西大学植物科学实验教学中心，南宁 530004）

0 引言

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)能与陆地生态系统中80%以上的高等植物根系共生形成共生体，即菌根(mycorrhiza)[1-3]。AMF可以促进宿主植物对水分和营养的吸收，促进宿主植物的生长[4-7]，但不同AMF对宿主植物吸收养分的促进作用不同，不同的宿主植物与AMF的共生状况也不同[8]；基质不同、营养元素含量差异等都会不同程度地影响菌根真菌与植物的共生关系[9]。有研究发现，AMF的生长繁殖与宿主植物的生长特性和状况密切相关，孢子的产量跟宿主植物的地下生物量有关，宿主植物的根系发达程度会影响孢子密度的变化，从而影响菌剂的扩繁[10]。因此，在菌根菌剂生产过程中应该选用根量大的宿主植物以生产高质量菌剂[8]。研究表明，玉米(Zea mays)、白三叶草(Trifolium repens)、高粱(Sorghum bicolor)、洋葱(Allium cepa)、大麦(Hordeum vulrare)、苜蓿(Medicago sativa)、花生(Arachis hypogaea)、青葱(Allium fistulosum)、棉 花 (Gossypiumhirsutum)、石 刁 柏(Asparagus officinalis)、百喜草(Paspalum notatum)、苏丹草(Sorghum sudanense)等均可作为AMF扩繁的候选宿主[11]。不同宿主可以选择性地促进或抑制一些AMF的生长发育，因此筛选某一特定菌种的最佳宿主在生产实践中具有重要意义。然而在南亚热带湿热地区，不同宿主植物对盆栽AMF扩繁的影响鲜有报道。本试验增设黑麦草(Lolium perenne)作为扩繁宿主，与常规宿主植物玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)、三叶草(Trifolium pratense)进行试验，探索不同宿主对聚丛根孢囊霉(Rhizophagus aggregatus)和幼套近明球囊霉(Claroideoglomus etunicatum)孢子密度、侵染率、接种势及扩繁效应的影响，以筛选合适的宿主植物，为南亚热带湿热地区AMF菌剂生产体系的建立提供科学依据和理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验供试菌种为：聚丛根孢囊霉（Rhizophagus aggregatus，以下简称RA），孢子密度为24个/g；幼套近明球囊霉（Claroideoglomus etunicatum，以下简称CE），孢子密度为26个/g。以上2种AMF均购自北京市农林科学院中国丛枝菌根真菌种质资源库（菌株编号分别为BGC BJ07、BGC HEN02A）。本试验采用盆栽的方法，塑料花盆高15 cm、直径20 cm，用灭菌河沙做扩繁基质。本试验宿主植物基本情况及来源如表1所示。

表1 宿主植物基本情况及来源

1.2 试验方法

试验于2018年3月20日—7月22日在广西大学农学院科研温室进行，温室温度控制在28℃。花盆用0.1%的高锰酸钾浸泡24 h后用无菌水冲洗干净，然后将AMF菌剂与灭菌河沙按AMF菌剂:灭菌河沙=1 g:40 g的比例混合均匀转移到花盆中。玉米、高粱均每盆播种10粒种子，出苗后间苗至6株/盆；三叶草和黑麦草每盆播种20粒种子，出苗后间苗至10株/盆。出苗至第60天，每周浇1次水，每次浇水量为200 mL；第61天至扩繁结束每3天浇一次水，每次200 mL；每2周浇1次霍格兰营养液，每次50 mL，为植物提供养分。在种植后的第30、60、90、120天收集宿主植物根系及根围的基质。基质置于无污染的自封袋中做好标记后带回实验室，常温风干至恒重后用于测定孢子密度；将不同宿主植物的根系分别另外装袋并做好标记带回实验室，用无菌水清洗干净后室温保存于50%乙醇中固定，用于染色并测定菌根侵染率。每个处理设置3组重复试验。

1.2.1 孢子密度的测定 取5 g土样，用湿筛倾析-蔗糖离心法[12]筛选出AMF孢子混合物，对培养皿中的孢子进行密度的观察，观察后用0.5～10 μL的移液枪小心将孢子吸到表面皿中，进一步观察形态、大小、数量等。

1.2.2 侵染率的测定 取固定好的宿主植物根系按透明—脱色—酸化—染色—褪色的步骤进行处理[13]，脱色结束后更换无菌水保存。取20条根段置于载玻片上，在光学显微镜下观察菌根的形态结构、侵入点、泡囊等，根段内观察到侵入点、菌丝、泡囊等都记做被侵染。根据每段根系菌根结构的多少按0%、10%、20%、30%、…、100%的侵染数量给出每条根段的侵染率，记录各侵染率下根段的条数。参照式(1)计算该样品菌根的侵染率[14-15]。

1.2.3 接种势的测定 接种势的测定方法见公式(2)。式(2)中，N为单位长度根段内含有的泡囊、孢子数和侵入点的总和，W为根重，K为单位质量根系长度，S为单位质量或体积接种剂内孢子数量[14-15]。由于不同种类宿主植物的根长、根重等差异很大，造成的差异会影响接种势的大小，从而影响其对AMF扩繁效应的比较，本研究在此接种势公式的基础上进行优化，以适于不同种类宿主对AMF的扩繁后接种势的比较。本研究将接种势公式优化为公式(3)。式(3)中，IR为AMF对宿主植物的侵染率，S为每克基质内孢子数量。

1.3 数据处理

试验数据用Excel 2016进行整理，并采用SPSS 19.0 Windows软件包进行统计分析，在5%和1%的置信水平下，通过单因素方差分析和最小显著性差异(LSD)计算，确定处理之间的统计显著性差异；用Sigma Plot 10.0及R 3.6.1(https://www.r-project.org/)进行作图。

2 结果与分析

2.1 不同宿主的菌根侵染率

由图1a可以看出，扩繁RA的试验中，第30～90天RA对三叶草侵染率的增幅最明显。扩繁第30天时不同宿主的菌根侵染率差异最小，该时期RA对玉米的菌根侵染率最大，高粱次之，两者均与三叶草和黑麦草的菌根侵染率之间存在极显著差异(P＜0.01)，RA对三叶草的菌根侵染率最小，为2.27%。扩繁第60天时不同宿主的菌根侵染率差异均达到极显著水平(P＜0.01)，菌根侵染率从大到小依次为玉米＞高粱＞三叶草＞黑麦草，玉米和黑麦草的菌根侵染率分别为36.60%和11.80%。扩繁第90天时，玉米的菌根侵染率为41.40%，三叶草的菌根侵染率为38.93%，两者均与黑麦草及高粱的菌根侵染率之间存在极显著差异(P＜0.01)，该时期RA对玉米的侵染率最高，为41.40%，对黑麦草的侵染率最低，为23.53%。扩繁第120天时，不同宿主的菌根侵染率之间差异均达到极显著水平(P＜0.01)，菌根侵染率从大到小依次为玉米＞高粱＞三叶草＞黑麦草，其中玉米和黑麦草的菌根侵染率分别为44.93%和18.93%。

图1 AMF在不同宿主上的菌根侵染率

由图1b可以看出，扩繁CE的试验中，菌根对宿主植物的侵染率与扩繁时间呈正相关。第30～60天三叶草的增长幅度最明显，第60～120天高粱的增长幅度最明显。扩繁第30天时CE对玉米的侵染率最大，对黑麦草的侵染率最低，两者之间的差异达到极显著水平(P＜0.01)，且与其他各宿主之间也存在极显著差异。扩繁第60天时玉米和三叶草两者分别与黑麦草和高粱之间存在极显著差异(P＜0.01)。扩繁第90天时三叶草和高粱两者分别与玉米和黑麦草之间存在极显著差异(P＜0.01)。扩繁第120天时玉米、高粱和三叶草的侵染率显著高于黑麦草(P＜0.01)，该时期CE对玉米的侵染率最高，为51.60%，对黑麦草的侵染率最低，为21.20%。

2.2 不同宿主扩繁AMF的孢子密度

由图2a可以看出，扩繁RA的试验中，扩繁0～60天玉米的孢子密度增加最快，并且第30天玉米的孢子密度显著高于三叶草和高粱，60天玉米的孢子密度显著高于其他各宿主。扩繁第120天基质中孢子密度由大到小为玉米＞高粱＞黑麦草＞三叶草，三叶草的孢子密度为78.67个/g，显著低于其他各宿主植物(P＜0.05)，玉米的孢子密度最大，为102.12个/g，与三叶草之间的差异达到极显著水平(P＜0.01)。

图2 不同宿主扩繁AMF的孢子密度

由图2b可以看出，扩繁CE的试验中，CE的孢子密度与扩繁时间呈正比，扩繁第0～90天高粱做宿主的孢子密度增长幅度最大。扩繁第30天高粱的孢子密度偏低，并且显著低于玉米、三叶草和黑麦草(P＜0.05)；第90天高粱的孢子密度超过其他各宿主植物，并显著高于黑麦草(P＜0.05)。扩繁第120天基质中孢子密度由大到小为高粱＞玉米＞黑麦草＞三叶草，高粱的孢子密度最大，为105.87个/g，与黑麦草和三叶草之间均存在极显著差异(P＜0.01)，黑麦草的孢子密度最小，为89.33个/g，与玉米之间均存在显著差异(P＜0.05)。

2.3 不同宿主扩繁AMF菌剂的接种势

由图3a可以看出，扩繁RA的试验中，玉米做宿主RA在每个时期的接种势均最高，黑麦草做宿主的扩繁能力最差。不同宿主对RA接种势的影响不同，三叶草在前3个时期增加幅度最大。黑麦草在前中期组间差异比较小，高粱的组间差异比较大。扩繁结束后接种势从大到小的宿主依次为玉米＞高粱＞三叶草＞黑麦草，玉米做宿主扩繁后的接种势为137.47。

图3 不同宿主对AMF接种势的影响

由图3b可以看出，扩繁CE的试验中，各宿主植物对CE的扩繁能力随着扩繁时间的增加而提高，玉米做宿主CE在0～90天的接种势均最高，高粱做宿主CE接种势的增长幅最大，黑麦草的增加幅度最小。黑麦草在各时期组间差异比较小，玉米在各时期的组间差异比较大。扩繁结束后CE的接种势从大到小依次为高粱＞玉米＞三叶草＞黑麦草，高粱做宿主扩繁结束后的接种势为153.53。

2.4 不同宿主扩繁AMF菌剂的扩繁效果

AMF扩繁后的孢子密度及扩繁效果如表2所示，不同宿主对RA的扩繁效果从高到低依次为玉米＞高粱＞黑麦草＞三叶草，玉米、高粱和黑麦草均与三叶草之间存在极显著差异(P＜0.01)；玉米扩繁后的基质中RA的孢子密度高于其他宿主，扩繁结束后玉米对RA的扩繁效果为325.56%。不同宿主对CE的扩繁效果从高到低依次为高粱＞玉米＞三叶草＞黑麦草，并且玉米和高粱的扩繁效果均极显著高于三叶草和黑麦草(P＜0.01)；高粱扩繁后的基质中CE的孢子密度高于其他宿主，扩繁结束后高粱对CE的扩繁效果为307.18%。

表2 不同宿主对RA及CE的扩繁效果

2.5 相同宿主对不同AMF菌剂的扩繁效果

扩繁结束后，相同宿主对不同AMF的扩繁效应如表3所示。同一宿主对不同AMF的扩繁效应不同，其中玉米、黑麦草对RA的扩繁效应优于CE，三叶草和高粱则相反。对RA和CE扩繁效应差异影响从大到小依次为黑麦草＞玉米＞高粱＞三叶草，除黑麦草对RA和CE扩繁效应的差异达到显著水平外，其他宿主对RA和CE扩繁效应虽然存在差异，但差异未达到显著水平。

表3 相同宿主对RA和CE的扩繁差异

2.6 AMF侵染率、孢子密度、接种势相关性分析

对AMF的侵染率、孢子密度及接种势进行相关性分析，发现AMF的侵染率、孢子密度以及接种势之间均具有显著正相关关系(P＜0.001)，结果如图4所示。侵染率对AMF接种势的影响高于孢子密度对接种势的影响，CE接种势受侵染率的影响更加明显，相关系数为0.97。AMF侵染率在一定程度上可以反映其孢子密度的大小，并且两者之间存在极显著相关性(P＜0.001)，CE侵染率和孢子密度之间的相关性要高于RA。

3 讨论与结论

AMF对宿主的侵染程度以及与宿主的共生状态与共生时间呈正比，但不会无限增加，在共生90天左右会达到一个稳定的共生状态。不同宿主受AMF侵染的情况不同，因而不同宿主对同一AMF扩繁的能力不同，相同宿主对不同AMF扩繁的能力也不相同，这与Selvakumarl、李媛媛等[8,16]的研究结果一致。本试验发现侵染率可以反映孢子密度大小，即菌根侵染率和孢子密度间具有极显著的正相关关系，这与Mathur及Al-Raddad[17-18]的研究结果不同。

在扩繁的第120天，三叶草和黑麦草扩繁的RA的接种势骤降，其中三叶草接种势骤降是由孢子密度下降导致的，黑麦草接种势骤降是由侵染率的下降导致的。可能是2个处理在试验后期遭受了二斑叶螨的为害，喷洒农药杀虫所致。说明AMF对农药非常敏感，农药对菌根侵染率、后代孢子产量、菌丝和活性均有抑制效应，施用农药会显著降低孢子的萌发率并显著抑制菌丝的生长[19-20]。不同农药对宿主AMF后代孢子产量及侵染率的影响程度不同。

本试验中，玉米扩繁RA和CE两种AMF的能力均最佳，说明本试验所选的4种宿主植物中玉米和RA、CE的共生能力高于其他宿主。结合前人研究结果分析，原因可能是：（1）玉米的根系较其他宿主更为发达，更有利于菌剂孢子的繁殖；（2）AMF与玉米共生对玉米根系的生物量提升高于其他宿主植物[21]，而有研究表明孢子的产量跟宿主植物的地下生物量有关，宿主植物的根系发达程度会影响孢子密度的变化，从而影响菌剂的扩繁[10]。说明宿主植物对菌剂扩繁的影响可能主要体现在根系发达程度以及宿主植物与真菌的相互选择性上[10]。

本试验中，AMF对黑麦草的侵染率始终低于其他宿主，说明黑麦草与RA、CE的共生能力较其他宿主植物弱，有研究发现菌根共生能力较弱的植物会降低混作在一起的菌根共生能力较强的植物的侵染率[22-23]，说明菌根共生能力较弱的植物会降低菌根的共生能力，不适合做AMF扩繁的宿主[24-26]。非菌根植物在有效磷资源缺乏的情况下，会通过自身生长和根系活动将土壤中的磷由不可利用形态转化为可利用形态，因而与AMF竞争土壤中的钙磷，接种AMF会降低非菌根植物的磷营养状况及生物量[26-27]，非菌根植物由于与AMF的共生能力较弱，所以不在AMF扩繁宿主的考虑范围之内。

除宿主植物不同会影响AMF的生长繁殖外，基质组分不同[9]、基质pH的差异、类黄酮物质[28]等都会影响AMF的扩繁效果。本试验在保证其他变量一致的基础上仅对不同宿主扩繁AMF效应进行了研究，后续研究将对其各影响因素进行组合研究，以期探索对AMF扩繁影响最大的因子，为AMF的扩繁提供更加充分的理论依据。

综上，AMF与不同的宿主植物之间以及不同AMF与同一宿主之间的亲和力均不同，即不同宿主对同一AMF的扩繁效应不同，相同宿主对不同AMF的扩繁效应也不同。AMF侵染率可以反映菌根真菌与植物的共生状况，在一定程度上也可以反映孢子的生长状况，并且AMF对宿主的侵染率与其孢子密度之间存在极显著的相关性。宿主植物对菌剂扩繁的影响，可能体现在根系发达程度以及宿主植物与真菌的相互选择性上，AMF的生长繁殖可能与宿主植物的生长状况密切相关，而且孢子密度以及对宿主的侵染率很可能与宿主植物的地下生物量以及根系形态有关。AMF对农药非常敏感，农药的使用会降低AMF的侵染率以及孢子密度。因此，为了提高AMF菌剂质量及接种势，针对某一AMF筛选最适的宿主植物是非常有必要的。

AMF的孢子密度及其对宿主的侵染能力不会无限增长，在共生前期增长迅速，而在共生后期则趋于稳定。同一AMF与不同宿主的亲和力不同，同一宿主对不同AMF的扩繁效应也不同。本试验结果表明，与豆科植物相比禾本科植物对AMF扩繁效应更高，RA的最佳扩繁宿主是玉米，CE的最佳扩繁宿主是高粱。