超声辅助酶法制备鸡皮胶原蛋白的工艺优化

魏沈芳，张顺棠，刘昆仑*，段晓杰，高立栋

1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001 2.莲花健康产业集团股份有限公司，河南 周口 466200

我国是肉鸡生产和消费大国，每年鸡肉消费量均在1 000万t以上[1]，其中鸡皮是主要副产物之一。大部分鸡皮被用于饲料或低廉的肉糜制品中，产品附加值低。研究表明，畜禽皮中富含不饱和脂肪酸[2]，蛋白质含量约为11%，其中85%为胶原蛋白(collagen)[3]，因此可将鸡皮作为蛋白质的优质来源。胶原蛋白是由3条α链通过肽链间的氢键相互右旋形成的三螺旋结构[4-5]，稳定性较高，分子量较大，占动物体内总蛋白的30%～35%[6-7]，这种特殊的三螺旋结构能使骨、皮、肌腱、血管等组织器官具备较高的机械强度，以支撑器官、维护机体正常生理功能[5]，对细胞、组织乃至器官行使正常功能以及损伤部位修复有着重大的影响[8]。

目前提取胶原蛋白的方法有热水浸提法、碱提法、酸提法、酶提法和复合提取法[6]。热水浸提法主要应用于鱼皮中胶原蛋白的提取[9]，碱提法通常用于明胶的提取[10]，且这2种方法由于温度、碱浓度等难以控制，易引起胶原蛋白的变性，从而失去生物活性[11]，因此很少应用。酸提法是用乙酸、柠檬酸等将胶原蛋白溶出，维持胶原蛋白的三级结构[12]，应用广泛，但是提取率较低[13]。酶提法是用胃蛋白酶限制性酶解胶原蛋白的端肽，使其更易溶出，且不破坏其特殊的三螺旋结构[14-15]，该方法能显著提高胶原蛋白的得率[14]。复合法是在前4种方法的基础上，加以超声波、脉冲等物理方法辅助提取。研究发现，超声波的空化效应和机械剪切力使蛋白质分子内部的基团暴露出来[16-17]，促进底物与酶的结合，故超声波辅助法可以显著提高胶原蛋白提取率，而且能改善其流变和功能特性[18]。如李根等[19]以鲵皮为原料，采用超声辅助酶法提取胶原蛋白，发现超声波辅助后提取率从17.56%提升至37.36%，且不会影响胶原蛋白特有的三螺旋结构；Ali等[20]以鲤鱼皮为原料，比较了酸提、酶提以及加入超声辅助对胶原蛋白的提取率与理化性质的影响，研究发现，在适当的条件下进行超声波处理，可以有效提高酸提和酶提的效率，且不影响胶原蛋白的理化性质；Petcharat等[21]以小丑鱼皮为原料提取胶原蛋白，发现超声辅助法能显著提高蛋白得率，且超声对分子结构没有产生不利影响。目前，超声波辅助法多用于提取水产动物副产物中的胶原蛋白，对畜禽类动物提取胶原蛋白的研究较少，且超声对其物化性质影响的研究不足。

作者以鸡皮为原材料，在低强度超声波的辅助作用下，采用酶法提取鸡皮中的胶原蛋白，并考察提取过程中各因素对胶原蛋白得率的影响，采用JMP软件定制试验，建立预测模型，优化提取工艺，以期为鸡皮胶原蛋白生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鸡皮购于当地市场，洗净，除去表面水分后，粉碎成约2 cm×2 cm的小块，-20 ℃冻藏备用。

羟脯氨酸含量检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；胃蛋白酶：上海源叶生物科技有限公司；氢氧化钠(粒)、正己烷、硼酸、硫酸钾、硫酸铜、氯化钠、溴甲酚绿、甲基红、冰乙酸：均为分析纯。

1.2 仪器与设备

WBL-2501A搅拌机：美的集团股份有限公司；JY92-ⅡN超声波细胞粉碎仪：新芝生物科技有限公司；YA1072透析袋(分子量8 000～14 000)：北京索莱宝科技有限公司；Kjeltec 8400全自动定氮仪：福斯分析仪器公司；GL-10000C冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

采用超声辅助酶法从鸡皮中提取胶原蛋白，具体工艺流程如下。

鸡皮→预处理(剪切、脱脂、去除杂蛋白)→清洗→酸溶胀→打浆→超声波处理→酶解→盐析→纯化→冻干→胶原蛋白。

1.3.1.1 预处理

将新鲜的鸡皮洗净，并用粉碎机粉碎成约2 cm×2 cm的小块，按质量比1∶ 2加入正己烷浸泡脱脂(振荡搅拌3 h，隔1 h换1次液)；按质量比1∶ 10加入0.05 g/100 mL NaCl溶液混合搅拌6 h以去除杂蛋白(每3 h换1次液)，并用蒸馏水洗涤3次。以上操作均在低温下进行，并在-20 ℃冷冻保存备用。

1.3.1.2 酸浸泡、打浆

取一定量预处理后的鸡皮，按1∶ 20 g/mL加入0.5 mol/L乙酸，4 ℃浸泡过夜，待原料溶胀均匀后打碎成糊状，使其充分混匀搅碎。

1.3.1.3 超声波辅助酶法提取

向打碎的鸡皮中继续添加20倍体积的乙酸(即最终加入的乙酸总体积为鸡皮质量的40倍)，搅拌成均匀的浆液后进行超声波处理(冰浴)。向超声处理后的鸡皮浆液中加入胃蛋白酶(15 000 U/g)，调节pH值至2.0左右，在4 ℃下搅拌6 h后，以10 000 r/min离心30 min分离上清液和沉淀，上清液即鸡皮胶原蛋白提取液。以上操作均在低温下进行。

1.3.1.4 中和、盐析

用浓NaOH溶液调节鸡皮胶原蛋白提取液pH值至7.0～8.0，搅拌并缓慢加入NaCl至浓度为1 mol/L，静置盐析直至出现白色絮状物沉淀后离心(5 000 r/min，20 min)，取沉淀，即得胶原蛋白粗提物。以上操作均在低温下进行。

1.3.1.5 纯化、冻干

将上述沉淀充分溶解于0.5 mol/L乙酸中，完全溶解后灌入透析袋(分子截留量8 000～14 000 Da)，0.1 mol/L乙酸为透析液透析24 h(每8 h换1次液)，再用蒸馏水透析24 h(每8 h换1次液)，经冻干得到胶原蛋白。以上操作均在低温下进行。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 鸡皮基本成分的测定

水分的测定：参照GB/T 5009.3—2016 直接干燥法；灰分的测定：参照GB/T 5009.4—2016 食品中总灰分的测定；粗脂肪的测定：参照GB/T 5009.6—2016 索氏抽提法；总蛋白的测定：参照GB/T 5009.5—2016 凯氏定氮法。

胶原蛋白含量的测定：用羟脯氨酸试剂盒(可见分光光度法)测定。胶原蛋白的含量可由L-羟脯氨酸(胶原蛋白的特征氨基酸)含量乘以换算系数得到[19]。以吸光值为纵坐标，羟脯氨酸含量为横坐标，制得标准曲线方程为y=0.005x+0.017 2，R2=0.995。通常，羟脯氨酸的含量占14%左右，陆生动物常用7.1为换算系数[22]。胶原蛋白的质量分数(%)=羟脯氨酸质量分数×7.1。

1.3.2.2 胶原蛋白提取率

1.3.3 提取工艺优化

1.3.3.1 单因素试验

前期预试验的基础条件为料液比1∶ 40 g/mL、酶用量1.0%、超声波输出功率130 W、超声时间(持续2 s，间歇2 s)2 min、酶解时间6 h。考察料液比(1∶ 40、1∶ 60、1∶ 80、1∶ 100、1∶ 120 g/mL)、胃蛋白酶添加量(0.5%、1%、1.5%、2.0%、2.5%)、超声功率(65、130、195、260、325 W)、超声时间(2、10、18、26、34 min)4个因素对胶原蛋白提取率的影响。

1.3.3.2 响应面优化试验

在以上单因素试验结果的基础上，以料液比(X1)、加酶量(X2)、超声功率(X3)、超声时间(X4)为自变量，-1、0、1为3个水平，提取率(Y)为响应值，进行响应面试验设计。

1.3.4 数据处理

使用SPSS 20.0进行数据显著性分析，应用JMP 14.0 设计试验及分析结果，利用Origin 2018 绘制响应面3D曲面图。

2 结果与分析

2.1 鸡皮基本成分

鸡皮的基本成分含量见表1。

表1 鸡皮基本成分Table 1 Basic composition of chicken skin

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 料液比的影响

鸡皮在乙酸溶液中会发生溶胀现象，导致溶液黏度较高，不利于空化作用的传导[23]，且会影响底物与胃蛋白酶的结合。随着料液比减小，体系的黏度降低，超声波的空化效应得到充分发挥，有利于胶原蛋白的溶出，提取率升高(图1)。当料液比为1∶ 80 g/mL时，提取率达最佳，为(24.33±0.54)%。但是料液比过小时，溶剂过多，降低了超声波在溶液中的能量分布，导致提取率下降[24]。因此，确定1∶ 80 g/mL为最佳料液比。

注：不同小写字母表示有显著性差异(P<0.05)。图2—图4同。图1 料液比对鸡皮胶原蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on collagen extraction rate

2.2.2 加酶量的影响

当酶用量增多，提取率呈先增加后降低的趋势(图2)。在加酶量小于1.5%时，底物与酶充分结合，胃蛋白酶的添加会提高胶原蛋白的提取率。当酶添加量为1.5%时，提取率达最佳，为(29.68±0.27)%。当加酶量大于1.5%时，蛋白与酶的结合位点达到饱和，此时酶的增加不再提高蛋白提取效率，反而产物浓度的增高会抑制酶促反应[25-26]，从而使提取率降低。因此，选择加酶量为1.5%。

图2 加酶量对鸡皮胶原蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of pepsin content on collagen extraction rate

2.2.3 超声功率的影响

随着超声功率的增加，超声波的微声流会加速传质扩散，产生空化、震荡效应，活化酶分子构象及催化部位[27]，提取率呈先上升趋势(图3)。当功率为195 W时，胶原蛋白提取率最高，为(34.90±0.16)%。但当功率继续增大时，提取率显著下降(P<0.05)。研究表明，当超声密度过大，产生散射衰减，形成声屏障，影响提取效果[28]。因此，选定超声功率为195 W。

图3 超声功率对鸡皮胶原蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on collagen extraction rate

2.2.4 超声时间的影响

超声持续时间的增加，胶原蛋白提取率先增加后降低(图4)。超声2～26 min，提取率逐渐上升，说明超声波辅助能显著增加胶原蛋白的提取率，在26 min时提取率达到最大，原料中胶原基本溶解。超声时间继续增大，超声的空化效应引起溶液局部遭受高温、高剪切力及过高的压强[29]，破坏多肽链上的氢键和范德华力，导致蛋白质发生变性[30]，蛋白质卷曲、再折叠，使暴露的酶位点包裹在蛋白质内部[31]，从而提取率下降。而18 min和26 min无显著性变化，考虑到时间过长增加能耗，因此，确定最佳超声时间为18 min。

图4 超声时间对鸡皮胶原蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on collagen extraction rate

2.3 响应面试验结果分析

2.3.1 回归模型分析

通过对上述单因素试验的结果分析，编制因素与水平编码(表2)。进行定制试验设计与结果分析(表3)，利用JMP软件得到超声辅助提取过程的回归方程，回归模型及系数方差分析结果如表4、表5所示。

对回归方程进行方差分析见表4，模型的F值为8.51，显著性检验P<0.05，说明该模型存在显著性差异，失拟项P=0.104 1>0.05 不显著，无失拟因素存在，表明该模型对数据的拟合程度高。胶原蛋白提取率与各因素间的线性关系显著(R2=0.894 9)，表明该模型可以很好预测响应值。

表2 因素与水平编码Table 2 Factor and level coding

表3 试验设计及结果Table 3 Experimental design and results

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

表5反映了4个因素与提取率(Y)的关系，回归模型系数中一次项X3、X4对Y的影响极显著，X1影响显著，X2的影响不显著，且二次项X22对Y的影响显著，说明因素X1—X4对Y的影响不是单一的线性关系。根据P值可以得到对Y影响程度的顺序为X4>X3>X1>X2。

表5 回归系数方差分析Table 5 Variance analysis of regression coefficient

2.3.2 双因子交互作用分析

用Origin 8.5绘制两个因素间交互作用的曲面图，见图5、图6。响应面曲面坡度可说明各因素对蛋白提取率影响的敏感度。图5为料液比(X1)和加酶量(X2)的交互作用，其中X1曲面相对陡峭，说明其对提取率的影响更大，这是由于乙酸溶液增多导致体系中胃蛋白酶浓度降低，酶无法充分与底物结合，从而降低提取率。从加酶量(X2)和超声功率(X3)的交互作用响应面图(图6)可以看出，加酶量(X2)曲面变化相对平滑，表明X3的变化对提取率(Y)的影响更大，这可能是由于超声的空化效应使底物分散并增加酶的催化效果，从而促进提取效率。

图5 料液比和加酶量交互作用对鸡皮胶原蛋白提取率影响的响应面图Fig.5 Response surface of effect of interaction between solid-liquid ratio and pepsin content on collagen extraction rate

图6 加酶量和超声功率交互作用对鸡皮胶原蛋白提取率影响的响应面图Fig.6 Response surface of effect of interaction between pepsin content and ultrasonic power on collagen extraction rate

2.4 最佳工艺确定

该试验的最大化意愿因素水平见图7。预测分析得出：料液比为1∶ 73 g/mL，加酶量为1.58%，超声功率为260 W，超声时间为26 min。此条件下鸡皮胶原蛋白提取率最大，为83.58%，预测最佳提取率为75.75%～91.40%。通过以上分析，以最佳提取条件进行胶原蛋白的提取，获得实际平均提取率为(83.42±0.65)%，试验值与预测值接近。

图7 试验预测刻画图Fig.7 Test prediction profile

3 结论

为了进一步提高鸡皮胶原蛋白的提取效率，采取超声技术辅助胃蛋白酶提取鸡皮中的胶原蛋白，并系统分析了提取过程中料液比、加酶量、超声功率、超声时间4个因素对提取率的影响，并采用JMP软件定制设计试验，对提取方法进行优化，得到各个因素对提取率的影响顺序为超声时间>超声功率>料液比>加酶量；最佳工艺为料液比1∶ 73 g/mL、加酶量1.58%、超声功率260 W、超声时间26 min，此条件下进行试验获得最佳提取率为(83.42±0.65)%，与模型预测值接近，证实该模型能用于鸡皮胶原蛋白提取率的理论预测，说明超声辅助酶法可以显著提高胶原蛋白得率，为鸡皮胶原蛋白工业化生产提供了理论依据。