彩色马铃薯新品系细胞遗传学观测及SSR分析

岳 东，于 卓，于肖夏，李佳奇，李景伟，杨东升，张海龙，李志聪

(内蒙古农业大学 农学院，内蒙古 呼和浩特 010019)

彩色马铃薯是指块茎薯肉为紫、红、蓝等颜色的一类特色型马铃薯，其不仅具有普通马铃薯(块茎薯肉为白肉或黄肉)的营养成分，还富含花青素，是一种很好的抗氧化剂，其抗氧化活性是白肉和黄肉马铃薯的3倍[1]。花青素是一种安全、无毒的可食用色素，同时还是一种很强的自由基清除剂[2]，它能够有效地防止诱导有机体突变物质的活性，具有抗氧化、抗衰老、抗突变和降血糖血脂等多种生理功能[3]，在保健、药用、鲜食、食品和化妆品添加剂等方面具有重要利用价值[4]。近年来，随着人们生活质量的提高，对彩色马铃薯的年需求量日益增大，但目前国内尚缺乏花青素含量高、产量、抗性等综合性状优良的彩色马铃薯新品种，急需开展新品种选育研究工作。国外关于彩色马铃薯遗传育种研究工作开展较早，并已育成一些综合性状较好的品种应用于生产，如英国育成的紫黑肉新品种(Congo和Negresse)和红肉突变体品种(King Edward)，美国育成的品种(Dark Red Norland和Red Norland)，日本育成的品种(Northern Ruby)等[5]。而我国对彩色马铃薯新品种的选育研究起步较晚，育成并大面积推广应用的品种较少[6-8]，远远不能满足产业化生产的需求。

为培育出适应内蒙古地区种植的彩色马铃薯优良新品种，近年来内蒙古农业大学马铃薯遗传育种课题组在广泛收集评价国内外彩色马铃薯种质资源的基础上，依据双亲生态适应性广、遗传差异大和优缺点互补的亲本组配原则，选用国外引进的马铃薯材料MIN-021、YSP-4、Red-P1与国内育成品种红美、紫彩1号作亲本，配制了4个杂交组合红美×YSP-4、MIN-021×红美、红美×紫彩1号和紫彩1号×Red-P1，从中选育出综合性状表现突出的6个优良彩色马铃薯新品系NNCS-6、NNCS-7、NNCS-5、NNCS-1、NNCS-33和NNCS-37。本试验以MIN-021为对照，对这6个新品系的细胞学特性(花粉育性和染色体配对行为)进行观测，并在DNA水平上进行了SSR遗传差异分析，以期为下一步彩色马铃薯新品种的育成登记和利用提供分子细胞遗传学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试彩色马铃薯杂种新品系为NNCS-6(红美×YSP-4)、NNCS-7(红美×YSP-4)、NNCS-5(MIN-021×红美)、NNCS-1(红美×紫彩1号)、NNCS-33(紫彩1号×Red-P1)和NNCS-37(紫彩1号×Red-P1)，对照(CK)为彩色马铃薯MIN-021。各材料均由本课题组提供，块茎表型特征见图1。本试验在呼和浩特市托克托县古城镇南的力图马铃薯育种试验基地进行。土壤质地为沙质壤土，pH值7.8左右，肥力中等，具有滴灌条件。种植方式为单垄穴播，株距30 cm，行距75 cm，播深约11 cm，各材料均种植200株。在植株生长发育期间适时灌水、施肥、清除杂草。

A.NNCS-6；B.NNCS-7；C.NNCS-5；D.NNCS-1；E.NNCS-33；F.NNCS-37；G.MIN-021(CK)。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉可育率测定 在彩色马铃薯开花期，随机取各供试材料的花朵装入塑封袋带回实验室，将花药中的花粉用镊子轻轻撒到载玻片上，滴1滴1%醋酸洋红染色液，染色12 s，在20倍显微镜下观察统计各材料的可育和不育的花粉粒数，约120个视野。观察的标准：染色深厚均匀、有饱满内容物的花粉粒视为可育花粉；染色浅、空瘪、畸形、瘦小的花粉粒视为不育花粉。

花粉可育率=可育花粉粒总数/观察的花粉粒总数×100%[9]。

1.2.2 染色体配对构型观测 在现蕾期，于9：00—11：00在田间取各材料的幼小花蕾，放入装有卡诺试液的试管中，带回实验室在4 ℃冰箱中固定24 h，后取出用蒸馏水冲洗3次，转到70%酒精的试管中，于4 ℃冰箱中保存备用。制片时，取花蕾置载玻片上，取出花药挤碎，去除杂质后在花粉母细胞上滴加卡宝品红染色15 s，放盖玻片用镊子轻敲、压片。在Olym-pusBX51显微镜40倍下观察统计染色体数目，于100倍的油镜下拍照，每个材料观察细胞数130个以上。

1.2.3 DNA提取及质量检测 在田间取各供试材料的幼嫩叶片装入冰盒带回室内，各称取0.3 g嫩叶放在研钵中，加适量液氮快速研磨成粉末，用北京天根有限公司生产的植物基因组DNA试剂盒提取其DNA。DNA上样液为5 μL，在1.6%的琼脂糖凝胶电泳上检测其质量。将符合要求的DNA稀释至50 ng/μL，置于-20 ℃冰箱中冷藏备用。

1.2.4 SSR引物来源及合成 从NCBI网站上发布的马铃薯引物序列中选取SSR特异性引物60对，委托上海生工生物有限公司合成。用6个彩色马铃薯新品系和对照MIN-021的基因组DNA为模板，进行SSR适宜引物筛选，从中选出扩增条带清晰、多态性好的SSR引物10对(表1)。

表 1 10对SSR适宜引物名称和碱基序列Tab.1 10 pairs of SSR suitable primer names and base sequences

1.2.5 PCR扩增体系与程序 SSR-PCR反应体系的总体积为20 μL，含dNTPs(0.225 mmol/L)1.3 μL，10×Buffer(Mg2+)2.1 μL，正反向引物各0.6 μL，DNA模板(50 ng/μL)2.0 μL，EasyTaqDNA聚合酶(5 U)0.1 μL，ddH2O 13.3 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。每个反应体系中加入变性缓冲液(10 mmol/L EDTA、98%甲酰胺、0.25 %二甲苯氰FF、0.25%溴酚蓝)5.0 μL，94 ℃变性5 min，取出放入4 ℃冰箱内保存备用。

1.2.6 电泳与银染 聚丙烯酰胺凝胶浓度为6%，上样量5.0 μL，额定功率70 W，预电泳30 min，对照为2.6 μL 的100 bp DNA Ladder。电泳85 min后将胶板取下于固定液(蒸馏水1 800 mL、冰乙酸20 mL、酒精200 mL)中固定20 min，蒸馏水速漂3 min，放入2%的AgNO3溶液染色15 min。蒸馏水清洗后置显影液(蒸馏水2 000 mL、NaOH 30 g、甲醛8 mL)中。待清晰稳定的DNA条带出现，将其取出进行固定、漂洗、风干，扫描拍照。

1.2.7 SSR多态性位点统计与聚类分析

统计SSR多态性条带依据0/1赋值法，出现条带的记“1”，无条带的记“0”。根据基因组DNA片段大小依次记录，并生成“0、1”二元数据矩阵。多态性条带位点百分率P=K/N×100%，K为扩增出的多态性条带位点数，N为扩增出的条带总数[10]。

利用NTSYS软件计算其遗传距离(GD)，以非加权配对算术平均法(UPGMA)对6个彩色马铃薯及对照材料进行聚类分析[11]。

2 结果与分析

2.1 供试材料花粉可育率的比较

由表2可知，对照材料的花粉可育率为75.21%，高于60%，表明其育性较高，可作母本或父本进行杂交利用。6个新品系中只有NNCS-1的花粉可育率低于50%，仅为44.00%，说明其育性较低，适合作母本材料进一步杂交利用；其余5个新品系的花粉可育率为60.70%～80.22%，均高于60%，表明它们适合作父本或母本材料用于杂交改良。

表2 6个彩色马铃薯新品系及其对照的花粉可育率Tab.2 Pollen fertility of 6 new-colored potato strains and controls

2.2 供试材料PMCM Ⅰ染色体配对构型的比较

由表3可知，6个彩色马铃薯新品系及对照材料的单价体变幅为2.80～8.45、二价体变幅为6.09～10.42、三价体变幅为2.99～7.35、四价体变幅为1.33～3.72，表明各材料间的PMCM Ⅰ染色体配对行为有一定差别。NNCS-33、NNCS-37、NNCS-6、NNCS-7、NNCS-5、NNCS-1和MIN-021材料(CK)的染色体配对构型分别为2n=4x=48=4.02Ⅰ+10.15Ⅱ+3.40Ⅲ+3.37Ⅳ、2n=4x=48=3.31Ⅰ+10.42Ⅱ+2.99Ⅲ+3.72Ⅳ、2n=4x=48=5.19Ⅰ+9.16Ⅱ+4.51Ⅲ+2.74Ⅳ、2n=4x=48=6.55Ⅰ+8.35Ⅱ+4.97Ⅲ+2.46Ⅳ、2n=4x=48=6.91Ⅰ+7.13Ⅱ+5.73Ⅲ+2.41Ⅳ、2n=4x=48=8.45Ⅰ+6.09Ⅱ+7.35Ⅲ+1.33Ⅳ、2n=4x= 48=2.80Ⅰ+9.38Ⅱ+4.51Ⅲ+3.23Ⅳ。各材料在PMCM Ⅰ(花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ)染色体配对构型见图2。

表3 6个彩色马铃薯新品系及其对照的PMCMⅠ染色体配对构型比较Tab.3 Comparison of PMCMⅠchromosome pairing configurations of six new-colored potato strains and control

A.NNCS-33；B.NNCS-37；C.NNCS-06；D.NNCS-07；E.NNCS-05；F.NNCS-01；G.MIN-021(CK)。

2.3 供试材料遗传差异的SSR分析

2.3.1 基因组DNA的质量检测 对6个彩色马铃薯新品系及对照材料的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳质量检测，通过观察结果，供试材料基因组DNA电泳条带清晰、稳定，无任何弥散和拖尾现象，表明各材料所提取的DNA质量高、符合SSR分析的要求(图3)。

M.DNA Marker DL2000；1.NNCS-33；2.NNCS-37；3.NNCS-6；4.NNCS-7；5.NNCS-5；6.NNCS-1；7.MIN-021(CK)。

2.3.2 彩色马铃薯新品系多态性分析 用筛选出的10对SSR特异性引物，对新品系NNCS-6、NNCS-7、NNCS-5、NNCS-1、NNCS-33、NNCS-37和MIN-021(CK)的基因组DNA进行PCR扩增，共得到174个扩增条带位点，其中多态性条带位点151个，每对引物平均扩增出多态性条带位点15.1个，多态性比率占86.78%，说明这6个新品系及对照材料间存在着明显的遗传差异。其中引物C60扩增出的多态性条带数与总条带数分别为13，17条，多态性比率最低为76.47%；C42的多态性条带数与扩增条带总数最多，分别为23，24，其多态性比率最高为95.83%；S7扩增出的多态性条带数与总条带数最少，分别为12，14条，多态性比率分别为85.71%(表4)。

表4 各新品系及其对照的SSR扩增结果Tab.4 SSR amplification results of each new strain and control

另外，从10对SSR引物中利用筛选出的1对特异性引物C42，建立了一张能清晰地识别6个彩色马铃薯新品系及MIN-021(CK)的SSR指纹图(图4)，这为下一步彩色马铃薯新品种的育成登记和利用提供了分子依据。由于不同引物在各株系间扩增出的SSR指纹图不完全相同，因此，能在彩色马铃薯杂种株系鉴定及DNA指纹图建立时最好选用1对能够清晰区别的SSR特异性引物。

M.100 bp DNA Ladder；1.NNCS-33；2.NNCS-37；3.NNCS-6；4.NNCS-7；5.NNCS-5；6.NNCS-1；7.MIN-021(CK)。

2.3.3 供试材料间的遗传距离及聚类分析 由表5可知，6个彩色马铃薯新品系及对照材料的遗传距离(GD)变幅为0.505 9～0.725 5，平均遗传距离为0.624 8。新品系NNCS-37与NNCS-1的遗传距离最大(0.725 5)，说明其亲缘关系较远；NNCS-37与NNCS-6的遗传距离最小(0.505 9)，表明其亲缘关系较近。

由图5可知，以GD值0.62为基准，将7个彩色马铃薯材料分成3类：新品系NNCS-37、NNCS-6、NNCS-7、NNCS-5和MIN-021(CK)为一类，说明它们之间亲缘关系相对较近；新品系NNCS-33和NNCS-1各单独为一类，表明这2个新品系与其他材料间的遗传差异较大。

图5 6个彩色马铃薯新品系及对照材料的聚类Fig.5 Clustering of 6 new-colored potato strains and control material

表5 各供试材料的遗传距离矩阵Tab.5 Genetic distance matrix of each tested material

3 结论与讨论

同源四倍体植物具有4条同源染色体，在减数分裂时，特定同源片段内仅允许2条染色体进行联会，其联会片段大小与联会解离程度和染色体交叉结点的形成有密切关系，因此，减数分裂中期Ⅰ的染色体存在1个单价体和1个三价体(Ⅲ+Ⅰ)、2个二价体(2Ⅱ)、1个二价体和2个单价体(Ⅱ+2Ⅰ)及1个四价体(Ⅳ)等多种构型，而且三价体和四价体可能以链状或环状形态存在，在减数第1次分裂后期Ⅰ，仅2Ⅱ构型通过联会产生均衡分离，其他构型均引起部分配子内染色体分配不均衡，最终引起花粉败育或花粉可育性降低[12-17]。郭鲜蒲[18]研究发现，同源四倍体马铃薯体细胞杂种8C20-1中出现的多分体比例高达92.31%，这与减数分裂过程中高频率多价体和落后染色体等异象有关，致使花粉粒不能正常发育。本试验对6个彩色马铃薯杂种新品系的花粉母细胞PMCM Ⅰ的染色体配对行为和花粉可育率观测发现，二价体出现频率高的新品系其花粉可育率亦相对较高，如新品系NNCS-37和NNCS-33的二价体频率均较高，分别为10.42和10.15，其花粉可育率亦较高，分别为80.22%和78.10%。而二价体频率低的新品系其花粉可育率亦较低，如新品系NNCS-1二价体频率最低(6.09)，其花粉可育率亦最低(44.00%)。这进一步说明同源四倍体彩色马铃薯杂种新品系的PMCM Ⅰ染色体配对构型中，二价体配对频率越高，其花粉育性亦越高，即二者呈正相关关系。

SSR(Simple Sequence Repeat)分子标记，又称微卫星DNA(Microsatellite DNA)，因其具有共显性、重复性好等优点，已被应用于作物遗传多样性分析、种质资源鉴定、遗传连锁图谱构建、重要数量性状QTL精细定位及标记辅助育种研究等方面[19-22]。评价不同马铃薯材料间的遗传差异程度是开展杂交改良的基础，通常亲本间遗传差异大，其后代性状变异的概率就大。在利用SSR标记分析马铃薯种质材料遗传多样性时，选择多态性丰富的引物至关重要。Duan等[23]用11对SSR引物对217个马铃薯种质材料进行遗传多样性分析，获得多态性条带位点129个，多态性位点比率高达97.73%。这表明SSR引物多态性与马铃薯遗传背景有关，当引物表现为高度多态性时有利于准确有效地区分试验材料。而高玉坤等[24]以65个马铃薯品种(系)为材料，利用29对SSR引物进行PCR扩增，获得100个多态性条带位点，多态性位点比率占65.77%，表明65个马铃薯品种(系)的遗传多样性处于中等水平，说明供试材料遗传背景相对狭隘。宋洁等[25]用14对SSR引物对国际马铃薯中心引进的32份马铃薯品系和35份国内马铃薯品种材料扩增得到多态性位点60个，其多态性比率为66.38%，证明这67份马铃薯材料遗传背景亦较窄。本试验以7个彩色马铃薯材料的基因组DNA为模板，利用筛选出的10对SSR适宜引物进行PCR扩增，平均每对引物产生15.1个多态性条带位点，多态性比率较高(86.78%)，并用1对特异性引物C42进行PCR扩增建立了一张能清晰区分7个材料的SSR指纹图，进一步表明这7个彩色马铃薯杂种材料间的遗传差异性较大，且所选的SSR特异性引物能准确识别出各彩色马铃薯新品系。

本研究明确了6个彩色马铃薯新品系NNCS-33、NNCS-37、NNCS-6、NNCS-7、NNCS-5、NNCS-1和MIN-021(CK)的花粉育性程度、PMCM Ⅰ染色体配对构型及其二者的关系。利用筛选出的10对SSR适宜引物，对7个彩色马铃薯材料基因组DNA进行PCR扩增共获得多态性条带位点151个，多态性位点比率为86.78%。用特异性SSR引物C42建立了能清晰地识别出6个彩色马铃薯新品系和对照材料的SSR指纹图。通过聚类分析查明了7个彩色马铃薯材料间的亲缘关系。该研究为进一步开展彩色马铃薯杂交改良、新品种育成、登记和利用奠定了基础。