巩膜重塑和巩膜干预在眼部疾病中的研究进展

王霄婧，仇 晨，钱韶红

0引言

巩膜是眼球中一种重要的支撑组织，其主要功能包括：(1)保护眼内结构，保持眼部组织的拉伸力和弹性，避免眼球损伤；(2)在波动的眼内压和频繁的眼球运动作用下，维持眼球的固定轴向尺寸，确保呈现稳定的视网膜图像；(3)帮助调节睫状肌的功能[1]。其在各种眼部疾病的发生、发展及治疗中有重要作用。

近些年来，随着科技发达进步，眼部疾病的检出率显著升高。而近视和青光眼是其中两种严重危害视力，影响生活质量的眼部疾病。近年来有研究证实，近视及青光眼与巩膜重塑密切相关，关于巩膜重塑的研究主要集中在近视和青光眼领域，其中有许多关键信号分子及通路参与调控这一复杂的过程，相关药物也已逐渐被发现和应用。本文将从巩膜角度出发，阐述巩膜重塑与眼部疾病相关的研究，并对巩膜干预在眼部疾病治疗中的可行性进行初步探讨。

1巩膜

眼球外壁由角膜和巩膜构成，其中角膜占前面约1/6的部分，与之延续的后面约5/6为巩膜。

1.1巩膜的构成及生物成分巩膜组织主要由成纤维细胞和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)构成。巩膜成纤维细胞主要位于胶原纤维之间，通常呈扁平的纺锤形，细胞内有扁平的核。其胞体具有较长的分支，可跨越较长的距离，但是相邻巩膜成纤维细胞之间几乎少有接触。巩膜成纤维细胞可合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白和蛋白多糖等多种ECM成分[2]。

巩膜ECM由胶原纤维、蛋白聚糖与少量弹性纤维组成，介导细胞间的转导信号，为细胞提供适宜的微环境，并且影响细胞的代谢、迁移、增殖和分化等[3]。

巩膜中的胶原纤维占巩膜干重的90%之多，其中包括约99%的Ⅰ型胶原纤维(type-Ⅰ collagen, COL1)，和少量Ⅲ型、Ⅵ型和Ⅴ型胶原纤维。巩膜由外至内可分为3层：巩膜上层、巩膜实质层和巩膜棕黑板层。巩膜不同部位的胶原纤维种类和分布略有不同。巩膜上层的胶原纤维较细，排列方向不规则；巩膜实质层的胶原纤维排列较致密，表面相互平行，内面向各个方向发出分支并相互融合形成交错；巩膜棕黑板层胶原纤维则更细小。

蛋白聚糖在巩膜干重中只占约0.7%～0.9%，但却是巩膜ECM中主要的水溶性成分。根据结构不同，蛋白聚糖可分为纤调蛋白聚糖(fibromodulin)、双链蛋白聚糖(biglycan)和蛋白聚糖聚合物(aggrecan)。其中纤调蛋白聚糖约占总量的74%，双链蛋白聚糖约占20%，蛋白聚糖聚合物约占6%。在巩膜中，蛋白聚糖的作用是维持胶原纤维的排列，稳定胶原分子间的相互作用，赋予巩膜水化性和柔软性。有研究敲除实验动物的蛋白聚糖基因后，发现巩膜胶原纤维的数量和直径发生变化，巩膜变薄，眼轴增长[4]。这可说明蛋白聚糖对胶原纤维组装和排列有着调节作用。

另外，在巩膜中还存在少量弹性纤维，弹性纤维由弹性蛋白和微纤维组成。弹性蛋白是一种非水溶性无定形物质，其可能与胶原纤维共同作用，赋予眼球更好的回弹力，从而抵抗由于眼内压力变化或眼球频繁转动引起的压迫、牵拉和扭曲。

巩膜的生物成分并非一成不变。在眼球的发育过程中，巩膜的结构和生物成分会随着眼内压和眼球运动而发生着动态改变。

1.2巩膜生物力学早期有关巩膜生物力学的研究并不多，而近年来随着检测方法的多元化，巩膜生物力学在眼部疾病中的作用逐渐被学者重视。

有研究对人近视眼巩膜进行力学测试，发现近视巩膜厚度变薄、承载能力减低、可扩展性增加、蠕变率增大，因此易发生变形[5]。另外有研究对青光眼患者巩膜进行膨胀试验(inflation testing)，测量巩膜受压情况下的位移，发现与正常眼相比，青光眼视盘周围巩膜切向应变和径向应变发生改变[6]。在动物的高眼压模型中，研究也发现视乳头旁区巩膜及筛板的硬度和厚度较正常眼明显增加[7]。因此，在眼部疾病的发生发展过程中，巩膜生物力学确实发生了改变，而学者们推测这一改变源于巩膜生物成分的变化。胶原纤维是一种黏弹性体，具有滞后性和蠕变性，较小的应变就可引起较高的应力，且巩膜不同部位的厚度、黏弹性和蠕变特性不同，这可能与巩膜不同部位胶原纤维排列方式不同有关。蛋白聚糖侧链上的糖胺聚糖带有大量负电荷，能吸引如钠离子这样的正电荷，这些阳离子可结合大量水分子，使糖胺聚糖吸水膨胀，从而维持巩膜黏弹特性，并赋予巩膜抗压能力[2]。因此，巩膜生物力学与巩膜生物成分密切相关。在近视及青光眼等多种眼部疾病中，巩膜生物力学变化可能是由于巩膜胶原纤维、蛋白聚糖所带电荷以及弹性纤维的形态、含量和排布发生变化所致。

综上所述，巩膜的生物力学与眼部疾病密切相关，且与巩膜生物成分密不可分。

2巩膜生物成分在眼部疾病中的变化

2.1胶原纤维在眼部疾病中的变化胶原纤维是巩膜ECM的主要组成部分，其在不同的眼部疾病中变化不同。

在近视眼中，大量文献证实了巩膜胶原纤维的含量和排布都发生了改变。在含量上，研究已经在动物实验中证实，近视巩膜中COL1的表达不断降低[8]；在排布上，McBrien等[9]发现随着近视发生发展，决定了巩膜胶原成熟度和抗拉能力的较大直径胶原纤维数量减少，而较小直径的胶原纤维数量增加。可见胶原纤维在结构、含量和排布上的改变与近视的发生发展密切相关。

而在青光眼领域，早在1989年Zeimer等[10]就发现，与正常人相比，青光眼视乳头区周围巩膜硬度增加。Girard等[11]在患有单纯性视神经萎缩的猴巩膜中发现了大量胶原纤维的重组和新合成。这提示视神经损伤可能与巩膜胶原纤维改变相关。

综上所述，胶原纤维作为巩膜的主要生物成分之一，其含量和排布的改变与眼部疾病的发生发展密切相关。

2.2蛋白聚糖在眼部疾病中的变化蛋白聚糖作为巩膜中主要的水溶性成分，其含量在眼部疾病中也发生改变。

早在1983年就有研究发现，与正常眼相比，高度近视眼巩膜的蛋白聚糖生化标志物含量明显减少[12]。肖卉[13]进一步发现，通过形觉剥夺及透镜诱导的近视豚鼠后极部巩膜各类蛋白聚糖的表达均显著降低，且应用阿托品治疗后，豚鼠后极部巩膜各类蛋白聚糖表达显著上调。而与近视相反，有研究发现青光眼患者巩膜中亮蛋白聚糖基因的mRNA水平显著增高[14]。

2.3弹性纤维在近视眼巩膜中的变化弹性纤维作为巩膜中维持弹性和抗压性的主要成分，在青光眼中的作用尤为重要。

有研究在电镜下对比了正常人和青光眼患者巩膜中的弹性蛋白形态，发现正常人视乳头旁巩膜中的弹性蛋白是直线型的，并与胶原纤维紧密结合，在早期青光眼巩膜中弹性蛋白没有发生明显变化，而晚期弹性蛋白呈弯曲型，与胶原纤维结合减少，并且这种现象在视神经损害严重的区域更明显[15]。

3眼部疾病中参与巩膜重塑调控的关键分子及相关通路

近年来随着巩膜生物力学和巩膜重塑在眼部疾病中渐渐被重视，越来越多的关键分子和相关通路也被发现参与了眼部疾病中巩膜重塑的过程。其中包括组织基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)、整合素(integrin)、缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)、生长因子、环腺苷—磷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)、赖氨酰氧化酶(Lysyl oxidase, LOX)、视黄酸(retinoic acid，RA)等。

3.1MMPs及TIMPs MMPs最早由Gross和Lapiere于1962年发现，是一类高度保守的酶，对组织ECM中各种蛋白成分有广泛降解作用。目前已发现MMPs至少包括28个成员，根据结构特性和底物特异性可大致分为：胶原酶(collagenases)、明胶酶(gelatinases)、溶血素(stromelysins)、基质溶素(matrilysins)、膜型MMPs(membrane-type-MMPs)和其他MMPs。MMPs在血管生成、细胞凋亡和组织修复中发挥作用。因此MMPs在各种疾病的发生发展过程中起重要作用，如血管疾病、骨科疾病、肾脏疾病、肿瘤、神经系统疾病和2型糖尿病等。其中MMP2与眼部疾病的关系最为密切。

MMP2属于明胶酶，定位于16号染色体，是包含13个外显子和9个内含子的DNA片段。在各种组织中，MMP2可调节ECM蛋白的合成与降解，影响细胞间的信息传递，参与调节细胞的增殖、迁移、分化、黏附、损伤修复及组织重塑。而在巩膜中，MMP2可降解巩膜ECM中含量最多的Ⅰ型胶原，使眼球在受到相同眼压的情况下易于变形[16]。

早在1995年，就已经有研究发现，近视动物模型眼巩膜中的MMP2活性增加[17]。Zhao等[18]进一步发现MMP2的表达增加先于形觉剥夺导致的近视形成，且敲除MMP2基因有助于抑制近视的形成。

因此，MMP2参与了近视巩膜重塑的调节，而其作用的具体上下游蛋白及相关通路正在逐渐被发现。Chen等[19]通过对正常豚鼠玻璃体腔内注射 Shh信号通路激动剂诱导近视，导致巩膜MMP2表达上调；而向近视豚鼠玻璃体腔内注射Shh信号通路抑制剂可使巩膜组织中MMP2表达下调，可以延缓近视发展；Liu等[20]发现近视动物巩膜中MMP2、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1, IGF1)以及信号转导和转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)的表达均随近视程度加深而增加。这些研究提示Shh信号通路和IGF1/STAT3信号通路可能参与调控近视巩膜中MMP2的表达。

随着对MMPs的深入研究，学者们发现了一类MMPs的内源特异性抑制剂——TIMPs，与MMPs共同参与调控巩膜巩膜重塑。Liu等[21]发现形觉剥夺诱导近视5d后TIMP2表达降低，且利用明胶酶活性平板法和酶谱法在体外实验中发现TIMP2对MMP2的激活和活性均有抑制作用。

综上所述，MMP2和TIMP2的共同作用对巩膜重塑起着重要调节作用，其相互作用的机制对于了解眼部疾病的发病机制及开发新的治疗方法十分重要。

3.2整合素整合素是一种细胞黏附分子，参与多种生命活动。在巩膜中，整合素是成纤维细胞的一种表面受体，其胞内结构较短，但可通过α-辅肌动蛋白、踝蛋白和黏着斑蛋白与细胞骨架相连，从而调控细胞与ECM之间的多种信号通路。

本试验将粗骨料分为两个级配(5 mm～20 mm和20 mm～30 mm)，等比例混合。混凝土配合比严格按照规范《水工混凝土试验规程》[12](SL 352—2006)设计，配合比见表1。

整合素由α和β两种亚基构成，不同的α、β链决定了整合素与ECM中蛋白的结合特异性。而在人巩膜成纤维细胞中主要存在的是整合素α1、α2和β1亚单位。Metlapally等[22]发现整合素α1β1主要与基底膜中的Ⅳ型和ⅩⅢ型胶原结合，而整合素α2β1主要与巩膜中的Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原结合。因此可以推测，整合素α2β1与巩膜重塑关系最为密切。

有研究发现，在形觉剥夺诱导的豚鼠近视模型中，后极部巩膜的整合素β1亚基表达减少，并通过级联效应引起巩膜重塑，眼轴延长[23]。王园[24]发现形觉剥夺性近视豚鼠后极部巩膜整合素α1、α2亚基表达减少，反之去遮盖后表达上调。

综上所述，整合素与整合素链接激酶相互作用，协同参与了眼部疾病中的巩膜重塑。

3.3HIF-1α 在生理条件下，巩膜不断接受光线刺激而发生光氧化作用，形成氧自由基，与此同时细胞内存在抗氧化物质如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等可及时清除氧自由基，维持巩膜氧自由基的生成与降解处于动态平衡状态[25]；在病理状态下，巩膜氧自由基生成过多或抗氧化能力不足，则可引发脂质过氧化反应，产生代谢物丙二醛(malondialdehyde, MDA)，引起细胞和组织损伤[26]。而HIF-1α则是维持巩膜氧稳态的重要调节因子之一。

在动物模型上有研究发现，近视巩膜存在缺氧现象，其中包括一系列缺氧信号通路的激活[27]。訾迎新等[25]发现形觉剥夺性近视豚鼠巩膜中HIF-1α表达及MDA含量明显升高，而SOD活力明显降低。Zhao 等[28]进一步发现在小鼠巩膜中，上调HIF-1α可导致近视，而下调则导致远视。另外有研究通过给近视豚鼠每天球周注射过氧化物酶体增殖物激活受体γ拮抗剂或激动剂进行对比，证实了过氧化物酶体增殖物激活受体γ通过调节HIF-1α，进而影响巩膜胶原水平[29]。

综上所述，HIF-1α参与眼部疾病中的巩膜重塑，然而其具体作用的上下游分子及信号通路及仍有待进一步研究。

3.4生长因子

3.4.1转化生长因子-β 转化生长因子(transforming growth factor，TGF)包括TGF-α和 TGF-β两种类型。TGF-α主要由表皮细胞、脑细胞和巨噬细胞产生，诱导上皮发育；而TGF-β则参与调节细胞的生长、分化、凋亡及免疫。目前普遍认为在巩膜中起主要作用的是TGF-β(包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)。

陈丽娟等[30]发现在TGF-β1作用下，人胚胎眼巩膜中COL1的表达增高，Smad泛素化调节因子2(Smurf2)的表达先增高后下降，因此推测TGF-β1可能通过调控Smurf2的表达从而诱导COL1的合成。另外一些研究在动物模型中发现近视巩膜中Smad3和COL1的表达都下降，且两者变化趋势高度一致[31]。两种结果都表明，TGF-β-Smad-COL1信号途径参与调控近视发展中的巩膜重塑过程。Li等[32]发现激活Wnt3/β-catenin信号通路可以减轻TGF-β1对COL1表达的影响，因此推测TGF-β1的作用受Wnt3/β-catenin信号通路影响。另外一些研究发现转录活性蛋白1(Sp1)是TGF-β1的下游信号转录因子，且TGF-β1-Sp1-COL1 信号通路在近视巩膜重塑中发挥重要作用[33-34]。Xie等[35]发现当作用于巩膜的机械应力增高时， TGF-β1表达升高，并影响巩膜成纤维细胞的胶原代谢。

除了TGF-β1，TGF-β2也参与了近视巩膜重塑的过程。有临床研究发现近视患者巩膜TGF-β2基因的表达与正常人有显著性差异[36]。在动物模型上也有研究发现的近视巩膜前部脱落细胞中TGF-β2的表达增高[37]。而最新的研究发现，近视巩膜TGF-β2的表达变化受Lumican基因突变调控[38]。

3.4.2碱性成纤维细胞生长因子成纤维细胞生长因子是一种多肽，主要由下丘脑和垂体分泌，可分为酸性和碱性两种类型。在人体中，碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor, bFGF)较多存在于基底膜和血管的内皮下ECM中，在巩膜、视网膜以及脉络膜中也存在少量bFGF。Rohrer等[39]发现在眼球生长发育的过程中，bFGF能通过抑制TGF的表达从而抑制近视发生。但Tian等[40]则认为bFGF是通过上调COL1和整合素的表达从而抑制近视发生。

3.5cAMP cAMP是一种广泛存在于各种组织细胞内的第二信使，可调控细胞的生长、凋亡、增殖、分化等，因此参与多种生命活动和生理功能。在体内，cAMP由腺苷酸环化酶催化合成，并由磷酸二酯酶催化降解为5’-AMP而失活。在巩膜中，有研究通过磷酸二酯酶抑制剂升高正常豚鼠巩膜cAMP水平，导致巩膜胶原纤维直径变细，最终诱导形成近视[41]。而注射腺苷酸环化酶激活剂使巩膜cAMP水平升高同样可导致巩膜中COL1的含量显著下降，诱导近视形成[42]。

综上所述，在巩膜中cAMP可能参与调控胶原纤维的形成和分解，而其具体机制仍有待进一步研究。

3.6LOX LOX是一种含铜的胺氧化酶，在体内通过赖氨酸残基氧化成醛，进而启动胶原蛋白和弹性蛋白的共价交联，促进胶原蛋白组装成胶原纤维。因此，LOX在巩膜中是一种重要的ECM酶类。Yuan等[43]发现形觉剥夺性近视豚鼠巩膜中LOX表达明显降低，且调节LOX的表达可改变巩膜胶原纤维的直径。因此推测，LOX可能与巩膜重塑密切相关。

3.7RA RA是一种全反式维甲酸，在体内参与调节细胞分化增殖和程序性死亡，因此在胚胎发育、组织分化、肿瘤细胞生长等多种生物过程中起重要作用。在眼内，RA在醇脱氢酶的作用下转化为视黄醛，与视网膜上的视蛋白结合构成视紫红质，从而引起视觉形成；视紫红质又在光的作用下分解成视黄醛与视蛋白，视黄醛又在视黄醛脱氢酶的作用下可再生成RA，进而形成一个视循环。

很早就有研究发现分离的视网膜色素上皮细胞能够在培养条件下影响巩膜细胞的生长[44]。而近年来的研究发现RA可以通过刺激视网膜TGF-β的分泌，从而延缓近视眼巩膜重塑[45]。这提示视网膜和巩膜之间存在传递信号的因子，而RA可能就是其中之一。

综上所述，RA是参与视网膜-巩膜信号传递的重要因子之一，很有可能参与了各种眼部疾病中的巩膜重塑过程。

4巩膜干预在眼部疾病治疗中的可能性

眼部疾病发生发展过程中，上述的关键分子和信号通路通过复杂的机制调控巩膜生物成分的改变，继而影响巩膜生物力学。

虽然目前巩膜生物学干预未在眼部疾病治疗中广泛运用和普及，但已有大量研究在动物模型中证实这些关键分子可作为巩膜干预的潜在靶点，在治疗眼部疾病方面具有一定的疗效。结膜下注射抗胆碱药物哌仑西平可以通过调节巩膜MMP2和TIMP2的平衡改善近视豚鼠的预后[46]；有研究通过球周注射抗氧化药物红景天苷(Salidroside)和芒柄花素(Formononetin)抑制HIF-1α，从而减缓小鼠近视发展；外源性球周注射bFGF通过增加巩膜COL1、整合素α2和整合素β1的表达，抑制近视形成[26, 39]。天然生物交联剂京尼平(Genipin)能通过巩膜交联，抑制豚鼠近视眼巩膜MMP2水平，促进COL1的表达，从而改善近视[47-48]，另外京尼平具有良好的有效性和安全性，可以避免现有已被临床批准的核黄素-紫外线a胶原交联方法对视网膜的毒性作用，因而可被用于治疗青光眼[49]；

最新研究发现了一些与近视中巩膜重塑相关的基因。如基因PDE4B 被证实可能通过PDE4B/cAMP信号通路调节巩膜COL1的含量，从而控制近视发展[50]；基因lumican过表达可以通过调节TIMP2、MMP2，从而导致近视[51]。越来越多的研究从基因角度，证明了巩膜生物学与近视的关系，这意味着巩膜基因治疗预防眼部疾病成为可能。

目前，大量研究已经证明通过干预巩膜的特定分子信号通路增加巩膜硬度，可对延缓近视有明确的疗效。然而在其他眼部疾病治疗方面，巩膜干预的治疗前景仍在研究中。例如在青光眼的发生发展中，巩膜硬度增加是一种危险因素还是保护因素仍有待进一步探讨。有学者认为随着年龄增长，巩膜中胶原交联增加、巩膜变硬，且青光眼发病率随年龄增长而增加，因此巩膜硬度增加是一种危险因素。而另一些学者认为变硬的巩膜可限制眼内压作用下的巩膜管扩张，减少视乳头位移，因此巩膜硬度增加可以保护视神经免受于机械性损伤，是一种保护因素。而最新的研究发现，通过建立大鼠慢性高眼压模型模拟青光眼的发生发展，在短期和长期高眼压作用下，巩膜生物成分的改变并不是单一的趋势，而是呈现复杂的动态变化[52]。因此，如何根据青光眼不同时期、眼内压的不同水平以及不同个体对青光眼视神经损害的不同易感性，来制定不同的巩膜干预方法，仍有待进一步研究。

5小结

综上所述，巩膜重塑是一种复杂的生物过程，与眼部疾病的发生发展密切相关。探索巩膜重塑的机制可能为巩膜干预在今后眼部疾病治疗方面提供新靶点和新思路。