超声波及其联合技术灭活细菌芽孢的研究进展

吕瑞玲，丁 甜，周建伟，刘东红,*

（1.浙江大学宁波研究院，浙江 宁波 315100；2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058；3.浙大宁波理工学院，浙江 宁波 315100）

近年来，食品安全问题频发，而食源性微生物及其分泌的毒素引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要原因之一[1]。国内常见的有沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌等食源性致病菌引起的食物中毒[2-3]。目前防止食品微生物腐败和污染最简单有效的方法是传统热处理，其作用模式主要为热对流和热传导。在热处理过程中，微生物胞内的蛋白质、核酸等物质发生变性，细胞膜流动性发生改变，从而导致微生物失活[4]。但热杀菌过程中的高温会导致食品质地、色泽、风味等严重劣化，生物活性物质被破坏严重，使其商业价值降低。随着生活和消费水平的提高，消费者的饮食观念已经从“吃得饱”转变为“吃得好”。传统的热处理已经无法同时满足微生物安全和日益增长的多样化需求。越来越多的新型非热加工技术（如微波、欧姆加热、高压加工、超声波等）应用于食品加工中。作为传统热处理的替代方法，非热加工技术可以在较短的加工时间以及较少的能源投入下保障食品安全，同时减少对食品品质的影响，逐渐被应用在食品工业中[5]。

超声波与传声媒介的相互作用蕴藏着巨大的能量，这种能量能在极短的时间内起到破坏微生物的作用。超声波用于食品杀菌，可在较大程度上降低杀菌强度，保持食品品质，减少功能成分的破坏，应用前景广阔。目前已有较多关于超声波及其联合技术灭活微生物的研究。因此，本文着眼于芽孢结构，对超声波及其联合技术灭活细菌及其芽孢的规律及机制进行系统总结，以期为超声波技术在食品杀菌领域的应用提供理论参考。

1 细菌芽孢结构及其抗性

1.1 芽孢组成和结构

细菌芽孢的结构如图1所示，由外到内分别为芽孢外壁、芽孢衣、皮层、芽孢壁、芽孢内膜、核心[6]。芽孢外壁是一个类似气球的结构，松散地环绕在芽孢外层，为芽孢提供了附着于表面的能力，对其抗性以及病原特性亦起着重要作用[7]。芽孢衣是多层的蛋白结构，可以与化学物质反应从而保护芽孢，例如限制一些溶菌酶的进入[8]。皮层对保持芽孢核心区域的低水分含量具有重要作用，皮层水解是芽孢萌发的必要步骤，因此皮层的通透性是芽孢萌发的指示剂[9]。芽孢内膜是维持芽孢抗性的关键部分，芽孢内膜致密、流动性低，能极大程度地阻挡水等小分子物质进入核心，保护核心内的核酸物质免受破坏。芽孢核心内因水分含量极低，且含有酸溶性小分子蛋白质（small acid-soluble protein，SASP）以及高浓度吡啶二羧酸（dipicolinic acid，DPA），有助于维持芽孢的休眠状态，显著增强芽孢抗性[6]。芽孢与营养体结构上的差别正是两者抗逆性不同的原因所在。

图1 芽孢结构示意图Fig.1 Structure of spores

1.2 芽孢外壁

芽孢外壁是一层气球状的结构，松散地附着在芽孢表面，占据很大的空间。芽孢外壁的脱落会显著改变芽孢的大小。凭借其最外层的位置与特殊的结构，芽孢外壁成为环境和自身免疫系统之间联通的纽带，与芽孢病原性以及宿主的先天免疫系统相互作用具有密切的关系[10]。此外，芽孢外壁的存在对蜡样芽孢杆菌芽孢黏附性具有重要贡献。Zhou Kexu等[11]采用流体动力学测定技术研究了芽孢形成的条件对芽孢杆菌芽孢黏附的影响。结果表明，存在芽孢外壁的芽孢（蜡样芽孢杆菌）比没有芽孢外壁的芽孢（枯草芽孢杆菌）对剪切应力的抵抗能力强得多。

与芽孢其他结构相比，目前对芽孢外壁成分以及功能的研究相对较少。芽孢外壁由一个基底层和包围在外面的头发状细毛组成（图2），贝壳状的基底层由多种不同的蛋白质组成[12]，芽孢杆菌胶原蛋白状的糖蛋白A（Bacilluscollagen-like protein A，BclA）是头发状细毛的主要组成成分，是一种芽孢的免疫抗原[13]。研究表明，BclA蛋白增强了与巨噬细胞之间的连接，BclA基因的敲除导致芽孢外壁的缺陷以及疏水性的变化[14]。芽孢外壁通过蛋白与蛋白的相互作用与芽孢衣锚定，与此相关的蛋白质有芽孢衣蛋白CotE，外壁和间隙蛋白CotY、ExsA、ExsB、ExsY等。这些蛋白质具体的功能虽然尚未明确，但芽孢衣的正确组装离不开CotE，CotE蛋白在芽孢外壁结构中亦发挥着重要作用，这个双重角色表明芽孢衣与芽孢外壁这两层中的蛋白在芽孢结构上具有协同作用[12,15]。此外，芽孢外壁中还含有调节芽孢萌发的酶，位于外壁中的特定区域[6]。

图2 芽孢外壁的结构模型[16]Fig.2 Structure model of spore exosporium[16]

1.3 芽孢抗性

芽孢具有致密的多层结构，高浓度的Ca-DPA维持核心内较低水分含量，SASP与DNA以网络的形式结合保护核心内DNA。因此，芽孢具有较强的抗性[16]，灭活芽孢需要在121 ℃下处理5 min以上。湿热处理后蛋白损伤以及变性是芽孢灭活最主要的原因，但致死的关键蛋白尚未有定论。湿热处理后部分灭活芽孢释放全部的DPA，DPA的释放是一个“全部或者没有（all-or-nothing）”的过程，并非是一个逐渐变化，并不存在部分释放情况的过程[17]。利用干热法将样品加热到120 ℃维持1 h也已被证实可有效灭活蜡样芽孢杆菌的芽孢[18]。

食品工业上常用的巴氏杀菌过程几乎能杀死所有潜在竞争的营养细胞，为芽孢的萌发和生长提供合适的环境[19]。为此，为了彻底灭活微生物以及芽孢，保障食品微生物安全，工业上采用较大安全系数，即升高温度或延长处理时间。而长时间暴露于高温会导致食物营养价值、质地、颜色、风味等的劣变。因此超高压、高压二氧化碳、脉冲电场、超声波等非热加工技术应运而生。通过联合热处理与非热处理，降低杀菌过程中的热强度，缩短灭菌时间，从而最大程度减少杀菌过程造成的食品品质下降[20]。目前，已有较多非热加工技术应用于芽孢灭活，但目前并没有非常有效的手段，芽孢灭活仍是食品加工中的一大难点。

早在18世纪紫外光（ultraviolet，UV）技术已经开始用于杀菌，UV作用于细胞DNA的嘧啶碱基，使其形成二聚体来干扰DNA复制，从而灭活微生物。杀死90%原有存活的炭疽杆菌营养细胞的UV剂量为60 J/m2，而杀死其芽孢的剂量则需810 J/m2[21]。最初推测芽孢对UV的抗性是由于芽孢衣结构，而Nicholson等[22]研究结果表明，SASP的存在使芽孢的DNA具有独特的结构，UV作用并不能使DNA像菌体细胞那样形成二聚体从而灭活。

超高压技术是一种高效的非热杀菌技术，但是单独利用超高压处理对芽孢进行灭活效果并不佳。Timson等[23]的研究结果表明，蜡样芽孢杆菌芽孢和枯草芽孢杆菌芽孢在1 034 MPa、35 ℃下可以存活90 min。超高压灭活芽孢的可能机制是高压导致芽孢萌发，萌发状态下芽孢失去其固有的抗性。因此超高压与其他技术对芽孢灭活有较好的协同作用，包括压力循环处理、高温或低温、抗菌剂等[24]。

高压脉冲电场利用短时、高电压脉冲的方式破坏微生物细胞壁，改变细胞膜渗透性，从而灭活食品中的微生物，并维持较好的食品品质[25]。但是高压脉冲电场在灭活芽孢方面的应用研究却较少。Qiu Xing等[26]对萎缩芽孢杆菌芽孢进行5 s、15 kV/cm的强脉冲电场处理（50 次），发现并未对其结构产生破坏作用。Hamilton等[27]得出了同样的结论，即高压脉冲电场处理并不能显著减少蜡样芽孢杆菌芽孢的数量。

芽孢的灭活一直是食品工业中的重大挑战，但目前单一的加工技术对芽孢灭活的效果均不显著。因此，利用结合其他加工技术的联合技术是保障食品品质与微生物安全的有效手段。

2 超声波杀菌效果及其机理的研究进展

2.1 超声波技术

超声波是频率大于20 kHz的声波，能够在液体介质中产生分子振动，从而产生破坏性物理效应。由于绿色安全无污染等特点，目前超声波在消泡、乳化、提取和废物处理等食品加工领域有广泛应用[28-29]。Lynn等[30]发现水池中的鱼暴露在超声波下发生死亡，对其原因进行深入研究，发现了超声波的生物学效应，并展开了超声波应用于杀菌的研究。高强度的超声处理对微生物及其芽孢有灭活作用，与此同时能最大程度保持食品的品质，是传统热处理手段的转型方向[31-32]。

2.2 超声波空化作用机制

超声波在液体介质中传播时，液体中形成微小气泡（即空化泡），在持续超声波作用下，不断聚集能量并生长（图3）。当能量达到空化泡破裂阈值时，空化泡破裂，产生瞬时高温（5 500 K）高压（50 MPa），形成空化效应；空化效应被认为是超声波发挥作用的主要效应[33]。

图3 超声波空化效应形成过程Fig.3 Development of ultrasonic cavitation

空化作用有两种不同的类型，各自作用不同。一种为稳态空化，超声波振动条件下形成的小气泡随着超声波振动发生对称性的膨胀和惯性压缩运动，气泡的直径增加，经数千次循环后，其大小在其平衡尺寸附近振荡但不发生内爆，随着气泡振动产生的空化作用使附近的流体发生回转运动从而产生微束流，该现象称之为超微束[34]；另一种称之为瞬态空化，高功率（振幅）条件下，存在于液体中的微气核空化泡在超声波的作用下振动，膨胀时压力低于流体蒸汽压，气泡变大，压缩时气泡收缩，内容物液化，由于气泡面积变大，内容物不能完全液化回流体中，此时一个循环完成；在某个压缩循环中，当气泡壁与超声波产生共振时，会导致气泡内爆，产生瞬时高温（5 500 K）和高压（50 MPa）[35]，从而产生极强的剪切力，并在该区域引发湍流[36-37]。

2.3 超声波杀菌效果

研究发现，超声波的振幅、强度、频率、暴露时间、处理温度等都会影响超声波对微生物的作用，但各个参数的作用范围目前还处于探索阶段。Soleimanzadeh等[38]的研究表明，由于高振幅的超声波对细菌的细胞壁和细胞膜破坏增强，因此超声波对金黄色葡萄球菌的杀菌效果随着振幅的增加而增加；此外，他们还研究了超声波占空比（超声时间与间歇时间之比）对杀菌效果的影响，结果表明占空比为7∶3时，超声波的杀菌效果最好，此时探头所产生的空化泡能更有效地破裂产生空化效应，达到最好的杀菌效果。食品的黏度、pH值、微生物种类等也对超声波杀菌效果有一定的影响[39]。微生物种类与其对超声波敏感性的关系研究较少，并且各种观点众说纷纭，缺乏统一的结论。Chandrapala等[40]认为微生物对超声波的敏感性与细胞大小和表面结构有关，细菌比真菌更敏感，厌氧菌比需氧菌更敏感，杆菌比球菌更敏感。但是Cameron等[41]的研究却表明超声波的杀菌效果与细菌大小及形状没有直接关系。比较革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌由于具有较厚的细胞壁，肽聚糖层致密，因此对超声波抗性较强，而革兰氏阴性菌对超声处理更敏感[42-43]。

许多研究结果表明超声波对细菌有显著的杀灭效果，尽管在不同体系下，不同微生物的灭活情况不尽相同。单独超声波处理并不能使杀菌量达到5（lg（CFU/mL））[44]。超声波与其他技术（如热处理、压强、热处理与压强、UV以及乳酸链球菌素、电位水等）均有显著的协同杀菌效果[45-46]。

2.4 超声波杀菌机制

目前为止，超声波的杀菌机制并未研究透彻，现有的研究报道多是对实验结果的分析与假设推测，没有完整地阐述其致死微生物的机制。大多数学者认为超声波灭活微生物主要是由声流和声空化产生的瞬时高温高压所引起的[47-48]，具体机制分为以下3 个方面：1）超声波空化作用产生的瞬时高温使胞内蛋白质变性[49]；2）空化作用形成的瞬时高压和剪切力能够破坏微生物细胞壁，同时使细胞膜薄化、渗透性发生改变[50]，从而导致胞内物质发生泄露造成细菌死亡；3）超声波形成的空化泡破裂过程中会产生自由基和过氧化氢，胞内物质氧化丧失原有功能[51]，进一步导致细菌死亡。

3 超声波联合技术灭活芽孢的研究进展

虽然单独超声波处理对芽孢灭活效果不佳，但是超声波处理可以显著降低芽孢的抗性[52-53]。因而与其他杀菌方法联合能显著提高芽孢灭活效率，如超声联合热、高压、杀菌剂、UV等杀菌手段均有较好的效果。表1总结了超声波联合其他技术对芽孢灭活作用的研究情况。

表1 超声波联合技术对芽孢灭活的研究情况Table 1 Inactivation effect of combination of ultrasonic and other technologies on bacterial spores

续表1

3.1 超声波联合热处理灭活芽孢的研究进展

Khanal等[57]对比了超声波与超声波联合热处理灭活蜡样芽孢杆菌芽孢的效果，结果表明，超声波不仅可通过诱导部分地衣芽孢杆菌芽孢萌发，显著降低其抗性，还可以灭活芽孢；而相比于单独超声波处理，超声波联合热处理可显著增加芽孢的灭活量，说明超声波与热处理对芽孢灭活具有协同作用。Evelyn等[59]的研究表明，超声波对产气荚膜梭菌芽孢的灭活遵循一级动力学模型。75 ℃联合24 kHz、0.33 W/g的超声波处理60 min后，产气荚膜梭菌芽孢的数量可降低1.5（lg（CFU/mL））。此时芽孢的灭活曲线不呈线性，但能够用Weibull模型很好地拟合。Fan Lihua等[61-62]研究表明超声波与热处理联用对芽孢有协同灭活作用，与此同时，对芽孢的各层结构如皮层、芽孢衣和芽孢内膜等均有一定程度的破坏，导致胞内物质的释放，从而引起芽孢的失活。超声波联合热处理后保留DPA的芽孢能够正常萌发，但后期的生长状态受到限制，同时合成ATP含量较少甚至不合成，表明超声波联合热处理对一些萌发后生长过程中的代谢关键酶有一定的损伤[62]。这与湿热灭活芽孢的机理[63]类似。此外，还有研究表明超声波联合热处理对米粥、牛肉浆以及奶酪浆中的蜡样芽孢杆菌芽孢灭活量分别是单独热处理的7、6 倍和4 倍；超声波辅助可以极大程度上降低单独热处理的强度，降低能耗，同时维持食品的品质[58]。

3.2 超声波联合压强灭活芽孢的研究进展

超声波与压强联合后，极大地增加了芽孢灭活率，芽孢的D值显著下降，且随着超声波频率的增加，灭活量增加[54]；超声波联合压强处理时增加压强在一定程度上能提高芽孢灭活量，但当压力超过500 MPa时，芽孢灭活效果不会进一步提高，由于在较高压力下，超声波可能无法克服过高压力和液体分子内聚的作用力，使超声空化现象受到抑制；超声波联合压强处理能使枯草芽孢杆菌芽孢对溶菌酶以及热处理等更敏感。将超声波处理与热和压强联用，即压热超声（manothermosonication，MTS）处理，对芽孢有较好的协同灭活效果，且芽孢灭活率也随处理温度的上升明显增加。超声波联合压强和MTS处理对细菌芽孢的灭活效应，可归因于局部温度升高、机械应力与自由基产生等因素[54]。

Silva等[64]探究了超高压预处理对橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢灭活效果的影响，结果表明在经过15 min、78 ℃、600 MPa的超高压预处理后，橙汁中的芽孢对超声波联合热处理的D值从28 min下降到14 min。经过超高压预处理后，为了达到相同的灭活效果，超声波联合热处理所需的温度比热处理所需的温度低8 ℃；对比单独的热处理，超高压预处理辅助超声波联合热处理技术可以显著提高芽孢灭活率，同时缩短热处理的时间以及降低热处理温度，充分体现了非热加工技术的优越性。

3.3 超声波联合电位水灭活芽孢的研究进展

电位水又叫电解水，是一种新型的广谱杀菌剂，在过去几十年中得到了广泛的应用。电位水处理是一种可持续的绿色处理方法，具有成本低、效率高、节省时间、对人类和环境安全等优点[65]。电位水抑菌效果的主要成分是次氯酸，它不稳定易分解，在环境中易被还原。因此电位水在消毒杀菌的同时，并不会导致有害物质的残留。此外，低pH值和高氧化还原电位也是其抗菌作用的原因[66]。电位水在大白菜、生菜、菠菜等蔬菜的防腐保鲜中的应用已经有所探究[66]。在日本和美国，它已作为食品添加剂应用于食品工业和医院等清洁系统中。有效氯质量浓度（available chlorine concentration，ACC）为191 mg/L的电位水处理20 min可使枯草芽孢杆菌芽孢数下降7.09（lg（CFU/mL）），并且灭活效果与电位水的ACC呈正相关[67]。电位水通过降低芽孢的胞内脱氢酶活性、改变细胞膜通透性、提高悬浮液的电导率，导致胞内大量K+泄露。此外，电位水破坏了芽孢的细胞壁和细胞膜，大量胞内蛋白质和DNA释放。超声波与电位水联合应用于芽孢灭活规律的研究仍为空白。研究超声波联合技术灭活芽孢，对于提高杀菌效率具有重要意义。

4 结 语

超声波联合技术用于食品杀菌，可较大程度保持食品品质，减少功能成分的破坏，应用前景广阔。但是，目前对于超声波灭活芽孢的研究仍然集中于效应方面的探讨，很少深入到超微结构和分子水平变化的层面上。并且，超声波灭活芽孢的途径尚不清晰，超声波空化效应对芽孢多层结构的损伤机制并不明确，芽孢热抗性降低的机制缺乏系统性研究。为了进一步研究超声波对芽孢灭活机制，推动超声波在食品加工中的应用，应对超声波灭活芽孢分子机制进行更深入的研究：可通过蛋白质组学深入分析差异蛋白的上下游调控关系，了解蛋白质在压力胁迫下的调控网络，对于蛋白质组学的结果，可以利用Western Blot或者质谱技术对其进行验证，确认芽孢应激的关键蛋白。此外，芽孢在合适的条件下会萌发成为营养体恢复生长，对食品安全造成威胁，可以进一步对超声波处理后芽孢的萌发情况以及萌发能力进行研究。