鲜活和死后小龙虾的冷藏特性比较

张艳凌，向俊飞，朱亚军，桑燕菲，姜绍通,2，陆剑锋,2,3，林 琳,2,3,*

（1.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽 合肥 230601；2.安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽 合肥 230601；3.农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230601）

小龙虾学名克氏原螯虾（Procambarus clarkii），属甲壳纲螯虾科。1929年由日本引入中国，最初在江苏省和安徽省生长繁殖，由于其繁殖能力强，幼体存活率高，现已遍布我国许多地区，成为我国最重要的经济淡水虾类资源之一[1]。2019年，我国淡水养殖的甲壳类产品总产量达393.05万 t，虾类产量315.18万 t，其中小龙虾产量208.96万 t，同比增长27.52%[2]。小龙虾的蛋白含量较高，脂肪和胆固醇含量极低，虾肉中的锌、碘、硒等微量元素含量较高且比例合理，是一种优质水产品。由于其肉质鲜美、风味独特、营养价值高，因而备受消费者的青睐[3]。小龙虾的生长季节性强，市场价格随季节呈巨大波动，且在加工和运输过程中极易腐败变质，因此，选择合适的贮藏条件显得尤为重要。

小龙虾的养殖地区主要集中在湖北、安徽、江苏等长江中下游地区，随着近几年小龙虾文化的升温，全国各地的饭店、大排档等餐饮行业和农贸市场对小龙虾均有较大需求量，而低温冷链是目前生鲜小龙虾的主要流通方式。低温保鲜是水产品保鲜最常用的手段，能够在一定时间内保持水产品的品质和口感，加之冷链技术的迅猛发展，低温保鲜在未来保鲜市场上仍具有明显优势[4]。目前国内外对小龙虾保鲜技术研究的报道较少，研究主要集中在小龙虾加工以及冷冻贮藏方面[5]。冷冻保存虽保质期较长，但冰晶的形成和生长会导致产品水分流失、蛋白质变性以及营养破坏严重，使产品口感和品质变差。同时由于消费习惯因素，目前市场对生鲜小龙虾仍有较大需求量。本实验对鲜活和死后的小龙虾在4 ℃和0 ℃贮藏条件下的品质变化规律和保藏特性进行研究，为生鲜小龙虾的运输、销售和加工过程的品质保持和监控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售鲜活小龙虾，体质量（23.28±1.60）g，购自安徽省合肥市星达城红府超市，保活运至实验室。

盐酸、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、硼酸、氢氧化钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；总巯基含量检测试剂盒 北京Solarbio公司。

1.2 仪器与设备

FJ-200高速分散均质机 上海标本模型厂；PHS-3C型精密酸度计 上海虹益仪器仪表有限公司；K9840自动凯氏定氮仪 山东海能科学仪器有限公司；CT15RT台式高速冷冻离心机 上海天美生化仪器设备工程有限公司；SC-100全自动色差仪 北京康光光学仪器有限公司；TU-1901分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；H1M多功能微孔板检测仪 广州市达瑞生物技术股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

选取大小均一的新鲜小龙虾，剔除缺损个体，随机分为4 ℃鲜活虾、4 ℃死后虾、0 ℃鲜活虾、0 ℃死后虾4 组。鲜活虾仅进行清洗，保持其鲜活；死后虾组为将鲜活虾清洗后去头处死。将鲜活虾和死后虾分别装入扎好孔的保鲜自封袋，再将其于4 ℃（冷藏）和0 ℃（冰藏）下进行贮藏，贮藏于0 ℃条件下的小龙虾加碎冰保存，碎冰与保鲜自封袋直接接触，每2 d换一次碎冰，每种样品定时取样进行指标测定。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 感官评价

由10 名感官评价人员组成感官评价小组，以10分制进行打分。根据表1的评分标准，从小龙虾的气味、外观、组织状态3 个方面进行评分，各项指标满分为10 分，10～9 分表示品质很好，8～7 分表示品质较好，6～5 分表示品质合格，小于5 分表示品质差，不可接受。

表1 小龙虾感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of crayfish

1.3.2.2 菌落总数测定

参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[6]测定菌落总数。

1.3.2.3 pH值测定

取5 g虾肉，加入45 mL蒸馏水进行匀浆，静置30 min后，用精密酸度计测定上清液的pH值[7]。

1.3.2.4 总挥发性盐基氮含量测定

参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的自动凯氏定氮仪法[8]测定总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量。

1.3.2.5 硫代巴比妥酸值测定

精准称取虾肉糜5.00 g于离心管中，加入25 mL质量分数为20%的三氯乙酸溶液和20 mL蒸馏水，均质1 min。静置l h后，在8 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，用蒸馏水定容至50 mL，取5 mL滤液，加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）溶液，沸水浴中反应25 min，取出，流动水冷却5 min，冷却后用分光光度计在532 nm波长处测定吸光度（A），以蒸馏水取代滤液为空白样，根据公式（1）计算TBA值[9-10]。

1.3.2.6 总巯基含量测定

称取约0.5 g虾肉，加蒸馏水制备成虾肉质量分数10%的匀浆，8 000×g常温离心10 min，取上清液，总巯基含量按试剂盒微量法进行测定，结果以虾肉质量计。

1.3.2.7 色差测定

取小龙虾虾尾的第2～3腹节，用全自动色差仪进行色泽测定，使用前用标准黑板调零，标准白板校正，记录其亮度（L*值）、红绿度（a*值）和黄蓝度（b*值）。L*值为正表示样品偏白，反之则偏黑；a*值为正表示样品偏红，为负表示样品偏绿；b*值为正表示样品偏黄，为负表示样品偏蓝，并根据公式（2）计算总体色差值（ΔE*）。每组至少取6 个样品进行测量。

式中：Ln*、an*、bn*分别代表第n天样品的L*、a*、b*值；L0*、a0*、b0*分别代表第0天样品的L*、a*、b*值。

1.4 数据统计与分析

每组实验至少重复3 次，用Microsoft Excel 2016软件进行数据分析，结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 24.0软件统计分析程序中的单因素方差程序对数据进行差异显著性分析，采用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 鲜活和死后小龙虾在不同冷藏温度下感官品质的变化

感官评分是衡量水产品腐败变质的指标之一，感官评分低于5 分表示样品已不可接受。新鲜小龙虾具有固有的腥味和香味，有光泽，肉质有弹性，组织紧密。由图1可知，新鲜小龙虾感官评分为9.73 分。随着贮藏时间的延长，各组小龙虾的品质均逐渐下降，这是由于蛋白质发生变性、微生物大量繁殖以及自身内源酶的作用[11]。贮藏4 d时，4 ℃死后虾的感官评分显著低于其他3 组小龙虾（P＜0.05），贮藏6 d后，4 ℃鲜活虾的感官评分显著低于其他3 组（P＜0.05）。4 ℃死后虾品质劣变速度最快，在第5天感官评分（5.12）已经接近限值，第6天仅为3.42 分。4 ℃鲜活虾在前6 d的感官评分与冰藏组无显著差异，但在贮藏6 d后感官评分呈直线下降，这是因为前6 d内小龙虾仍然保持生命力，在第9天时感官品质已经不可接受。两个冰藏组的小龙虾感官评分下降趋势基本保持一致，差异不显著（P＞0.05）。0 ℃鲜活虾的感官评分在第13天达到不可接受值，而0 ℃死后虾的感官评分在第12天就已低于不可接受值。总体来看，0 ℃冰藏小龙虾的感官品质优于4 ℃冷藏小龙虾，可能是因为在冰藏条件下，微生物的生长繁殖速度更慢，酶活性更低，从而能有效延缓小龙虾的品质劣变。鲜活虾直接冷藏的效果好于死后虾直接冷藏，但在冰藏条件下，鲜活虾和死后虾的感官品质相差很小。

图1 鲜活和死后小龙虾在不同冷藏温度下感官品质的变化Fig.1 Sensory quality changes of live and dead crayfish at different storage temperatures

2.2 鲜活和死后小龙虾在不同冷藏温度下菌落总数的变化

菌落总数是反映小龙虾品质的重要指标。已有研究表明，虾类的菌落总数不大于5.0（lg（CFU/g））时为一级鲜度，在5.0～5.7（lg（CFU/g））之间为二级鲜度，超过6.0（lg（CFU/g））则认为不可食用[12-13]。如图2所示，新鲜小龙虾的初始菌落总数为4.79（lg（CFU/g）），处于一级鲜度。随着贮藏时间的延长，各组小龙虾的菌落总数均呈上升趋势。4 ℃冷藏组小龙虾的菌落总数增长速度明显高于0 ℃冰藏组，这可能与冷藏过程中小龙虾直接与空气接触，好氧菌大量繁殖有关[14]。4 ℃死后虾的菌落总数在第5天就达到6.05（lg（CFU/g）），略微超过可食用限值，此时其感官评分仍在可接受范围内，第6天其菌落总数为6.96（lg（CFU/g）），不可食用。4 ℃鲜活虾在前6 d仍处于二级鲜度，直至第8天菌落总数达到5.94（lg（CFU/g）），第9天时达到6.84（lg（CFU/g）），超出食用限值。冰藏条件下，小龙虾的菌落总数在前期缓慢上升，后期增长较快。两组冰藏虾在前2 d均为一级鲜度，前10 d仍处于二级鲜度范围内。0 ℃死后虾的菌落总数在第12天达到6.17（lg（CFU/g）），超过可食用限值，而0 ℃鲜活虾在第12天的菌落总数为5.91（lg（CFU/g）），至第13天超过可食用限值。冰藏条件下碎冰使贮藏温度较稳定地维持在0 ℃，从而有效抑制了细菌的繁殖[15]。整个贮藏过程中，4 ℃死后虾的菌落总数均显著高于其他3 组小龙虾（P＜0.05），4 ℃鲜活虾菌落总数显著高于2 个冰藏组小龙虾（P＜0.05）。在贮藏过程中，冰藏条件下的两组小龙虾菌落总数差异不显著（P＞0.05）。实验结果表明，小龙虾死后微生物生长繁殖速度较快，不同温度下细菌活动情况有明显差异，温度越低，细菌生长越慢。

图2 鲜活和死后小龙虾在不同冷藏温度下菌落总数的变化Fig.2 Changes in TVC of live and dead crayfish at different storage temperatures

2.3 鲜活和死后小龙虾在不同冷藏温度下pH值的变化

由图3可知，新鲜小龙虾的初始pH值为7.18，在贮藏初期pH值均呈下降趋势，其中4 ℃鲜活虾的pH值在前4 d呈先上升后下降的趋势，后期一直上升，而其他3 组小龙虾的pH值仅在前2 d出现下降，2 d后处于上升趋势。鲜活小龙虾死后糖原发生无氧酵解，在ATP酶和产酸菌的作用下生成乳酸和磷酸等有机酸，酸性物质的积聚导致pH值的下降。随着贮藏时间的延长，蛋白质在微生物和内源酶的作用下发生分解，生成氨基酸和氨、胺类等碱性物质，pH值又开始上升[16]。由于小龙虾肌肉组织pH值的变化与其生理状态、生长环境以及贮藏条件等有关，故pH值仅可作为参考指标，在一定程度上反映虾肉的鲜度[17]。贮藏4 d后，冷藏组小龙虾的pH值上升速度高于冰藏组。冰藏条件下两组小龙虾的pH值无显著差异（P＞0.05），在贮藏后期一直保持平稳上升趋势，说明冰温能更好地降低内源酶活性，抑制微生物的作用，从而延缓pH值的上升速率。

图3 鲜活和死后小龙虾在不同冷藏温度下pH值的变化Fig.3 pH changes of live and dead crayfish at different storage temperatures

2.4 鲜活和死后小龙虾在不同冷藏温度下TVB-N含量的变化

TVB-N是指动物性食品在微生物和酶的作用下，其中的蛋白质和非蛋白质含氮化合物被分解产生具有挥发性的氨以及低级胺等碱性含氮物质。这类物质会产生腐败的胺臭味，从而影响感官评分，其含量越高，表明氨基酸被破坏得越多，是反映水产品腐败程度的重要指标之一[18]。由图4可知，在两种贮藏温度下，小龙虾的TVB-N含量均随贮藏时间的延长而增加。冷藏组小龙虾TVB-N含量的增长幅度明显大于冰藏组，这与低温使非蛋白质含氮物质的脱氢和脱羧能力降低，从而降低蛋白质结构的破坏程度有关[19]。在贮藏后期，微生物的活动加强，分解大量氨基酸，脱氨基速度加快，导致TVB-N含量显著增加。根据GB 10136—2015《食品安全国家标准 动物性水产制品》的规定，动物性水产品的TVB-N含量不得超过30 mg/100 g。4 ℃死后虾的TVB-N含量在2 d后呈明显上升趋势，且在4 d后始终显著高于其他3 组（P＜0.05），第5天时的TVB-N含量达到27.96 mg/100 g，接近限值。冷藏条件下，鲜活虾的TVB-N含量在贮藏4 d后显著高于冰藏组（P＜0.05），在第8天时TVB-N含量由初始的7.17 mg/100 g上升到28.07 mg/100 g，第9天时（38.46 mg/100 g）超出限值。冰藏条件下，两组虾的TVB-N含量上升趋势保持平稳且总体差异不显著（P＞0.05），死后虾在第12天时的TVB-N含量达到33.17 mg/100 g，达到货架期终点，而此时鲜活虾的TVB-N含量为28.14 mg/100 g，到第13天时鲜活虾TVB-N含量超过限值。TVB-N含量的变化趋势与菌落总数一致。

图4 鲜活和死后小龙虾在不同冷藏温度下TVB-N含量的变化Fig.4 Changes in TVB-N content of live and dead crayfish at different storage temperatures

2.5 鲜活和死后小龙虾在不同冷藏温度下TBA值的变化

TBA值可用来衡量脂质的氧化程度[20-21]。由图5可知，各组小龙虾的TBA值均随贮藏时间的延长而增加，这可归因于脂质氢过氧化物和过氧化物的降解产物的积累[22]。有研究表明，鲜肉TBA值在0.501～0.865 mg/kg之间，TBA值大于1.0 mg/kg则为变质肉[23]。虾肉的TBA值一直保持在0.865 mg/kg以下，这主要是因为虾肉中脂肪含量较低。在贮藏过程中，小龙虾的TBA值逐渐升高，这是虾肉中的不饱和脂肪酸被氧化成醛酮类化合物所导致的。新鲜小龙虾的初始TBA值为0.18 mg/kg，冷藏组小龙虾的TBA值在后期升高较快，而冰藏组小龙虾的TBA值增长速率较慢，主要是因为冷藏组的温度更高，且与空气直接接触，虾肉中不饱和脂肪酸更容易被氧化。贮藏2 d后，4 ℃死后虾的TBA值显著高于其他3 组（P＜0.05）。4 ℃鲜活虾和0 ℃冰藏小龙虾的TBA值在贮藏前6 d增加缓慢且差异不显著（P＞0.05），之后4 ℃鲜活虾的TBA值上升较快，到第8天时TBA值为0.45 mg/kg。冰藏条件下鲜活虾和死后虾在前10 d的TBA值无显著性差异（P＞0.05），并分别在第12天和第13天才超出0.501 mg/kg。

图5 鲜活和死后小龙虾在不同冷藏温度下TBA值的变化Fig.5 Changes in TBA value of live and dead crayfish at different storage temperatures

2.6 鲜活和死后小龙虾在不同冷藏温度下总巯基含量的变化

巯基被认为是蛋白质中最具功能性和反应活性的官能团，具有稳定肌原纤维蛋白空间结构的作用，在低温或加热时易被氧化形成二硫键，巯基与蛋白质的变性和聚合关系密切[24]。低温贮藏过程中，蛋白质发生变性，导致肌球蛋白的构象变化，特别是在头部区域，在对太平洋鳕鱼冰温贮藏特性的研究中发现，蛋白质变性反应在前5 d迅速发生，这些变化可能导致活性巯基暴露，从而氧化形成二硫键，导致总巯基含量的下降和二硫键含量的上升[25-27]。由图6可知，冷藏条件下，死后虾的总巯基含量始终显著低于其他3 组小龙虾，到贮藏末期（6 d）时下降了49.28%；鲜活虾的总巯基含量在前期下降较为平缓，6 d后开始迅速下降，且在8 d后显著低于冰藏组小龙虾总巯基含量（P＜0.05），到第9天时下降了44.20%。冰藏条件下，小龙虾的总巯基含量下降较缓且两组之间差异不显著（P＞0.05），到贮藏末期，鲜活虾和死后虾分别下降了39.13%和40.58%。由此可见，贮藏温度对总巯基含量的影响较大，温度越高，巯基含量下降越快。总巯基包括活性巯基和隐藏的巯基，贮藏初期主要是表面的活性巯基逐步被氧化为二硫键，随着贮藏时间延长，虾肉蛋白变性、分解，隐藏的巯基逐步暴露并氧化为二硫键，因此总巯基含量下降[28]。

图6 鲜活和死后小龙虾在不同冷藏温度下总巯基含量的变化Fig.6 Changes in total sulfhydryl content of live and dead crayfish at different storage temperatures

2.7 鲜活和死后小龙虾在不同冷藏温度下色泽的变化

颜色在小龙虾的外观和可接受性中起着重要作用。通常，由于脂质氧化和色素降解，小龙虾在低温贮藏期间会发生颜色变化[29]。从图7A可以看出，冷藏组小龙虾肉的a*值随贮藏时间的延长而上升，其中死后虾的a*值上升速度更快，说明虾肉颜色逐渐发红。冰藏组小龙虾肉的a*值整体呈下降趋势，说明虾肉的红度逐渐降低，这可能与虾肉组织内部分自由水形成了冰晶有关。有研究报道，冰可以阻止冷藏期间a*值的增加[30]。Thanonkaew等[31]对乌贼的研究发现TBA值与b*值呈正相关，这是由于不饱和脂肪酸氧化产生的自由基和羰基化合物与蛋白质中的游离氨基发生反应，随后缩合成棕色色素。由图7B可知，两种贮藏条件下，虾肉的b*值均呈上升趋势，且冷藏组b*值的上升速度明显高于冰藏组，这与TBA值研究结果相吻合。温度越高，脂肪氧化速率越快，产生的自由基对虾肉中色素的破坏越严重[32]。由图7C可知，在贮藏过程中，虾肉的L*值整体呈下降趋势，但下降程度较低，表明虾肉颜色随贮藏时间延长而逐渐加深，这可归因为贮藏过程中虾肉的水分逐渐流失。ΔE*值代表总体色差，如图7D所示，所有组的虾肉ΔE*值在前4 d均上升较缓，之后4 ℃死后虾的ΔE*值在呈直线上升，而在冰藏条件下虾肉的ΔE*值增长速度较慢，可能是因为贮藏温度越低，酶的活性低，虾体色泽褐变的速度也就越慢[33]。

图7 鲜活和死后小龙虾在不同冷藏温度下色泽的变化Fig.7 Color changes of live and dead crayfish at different storage temperatures

3 结 论

随着贮藏时间的延长，在4 ℃冷藏和0 ℃冰藏条件下，小龙虾的品质均发生了劣变，与4 ℃常规冷藏相比，0 ℃冰温贮藏条件下，小龙虾品质劣变速度较慢。在贮藏期间，小龙虾的菌落总数、pH值、TVB-N含量和TBA值上升，感官评分和总巯基含量下降，颜色出现褐变和黑化。死后虾在冷藏条件下贮藏5 d时，其TVB-N含量为27.96 mg/100 g，感官评分为5.12 分，而菌落总数为6.05（lg（CFU/g）），均超过限值，说明超过货架期。鲜活虾在冷藏条件下贮藏9 d时，其TVB-N含量达38.46 mg/100 g，菌落总数为6.84（lg（CFU/g）），感官评分低于5 分，不可食用。死后虾在冰温条件下贮藏12 d，其TVB-N含量和菌落总数分别达到33.17 mg/100 g和6.17（lg（CFU/g）），超过限值，说明超过货架期。鲜活虾在冰温条件下贮藏13 d，其TVB-N含量和菌落总数均超出限值。

综合各项指标变化的结果，鲜活虾和死后虾在冷藏条件下的货架期分别为8 d和4 d，在0 ℃冰藏条件下的货架期分别为12 d和11 d，且在0 ℃冰藏条件下货架期间两者品质的差异不显著。因此，在生鲜小龙虾的运输、销售和加工过程中，建议采用0 ℃冰温贮藏，保存期不超过11 d，如在4 ℃条件下冷藏，鲜活小龙虾的贮藏时间建议控制在8 d内，死后小龙虾的贮藏时间在4 d以内。