桑葚多糖对镉源性肝损伤小鼠的保护作用

李变丽，陈华国，赵 超，龚小见，周 欣,*

（1.贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550002；2.贵州师范大学喀斯特山地生态环境保护与资源利用协同创新中心，贵州 贵阳 550001；3.贵州师范大学 贵州省药物质量控制及评价技术工程实验室，贵州 贵阳 550001）

镉是当今社会常见的环境和工业污染物，主要通过呼吸道、消化道或者皮肤被机体吸收，是一种毒性大、蓄积性强的重金属毒物[1-2]。镉对人体多种组织器官均有潜在的致癌性，1993年国际肿瘤研究机构将其列为I类致癌物[3]。当摄取量达到一定的程度后，可引起肝脏、肾脏等器官及心血管等系统的损伤。其中，镉中毒导致的肝损伤主要表现为肝硬化、肝纤维化等，若不及时治疗，进而可发展为肝癌[4]。“湖南镉大米事件”“河南镉小麦事件”等重大公共卫生事件的发生表明镉污染带来的食品安全问题会严重威胁人体健康[5]。研究发现，药食两用中药安全性较高、依从性较强[6]，可以避免保肝药产生的二次药物性肝损伤。如小叶丁香（药食同源类中药）提取物丁香苷、紫丁香苷等可以有效降低小鼠肝脏内的镉含量，对镉源性肝损伤具有保护作用[7]。

桑葚又称桑椹子、桑果等，是桑（Morus albaL.）的成熟果穗，富含多种维生素、葡萄糖、蛋白质、花青素、白藜芦醇及矿物质和微量元素硒等多种成分，被称为“民间圣果”“21世纪最佳保健果品”，属于药食两用食品[8-10]。《本草备要》中记载“桑葚甘凉，利五脏关节，安魂镇神，聪耳明目，生津止渴，利水消肿”。现代医学研究表明，桑葚具有补肝益肾、抗衰老、润肠通便等作用[11]。本课题组在前期的研究中发现，桑葚多糖（Mori Fructuspolysaccharide，MFP）可通过发挥抗氧化作用，对酒精性肝损伤起到保护作用[9]。本研究以镉源性肝损伤小鼠为模型，探讨MFP对其肝损伤的保护作用，以期为开发保肝、护肝型保健食品和药食同源类提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级雄性昆明小鼠80 只（体质重18～22 g），4 周龄，购于长沙市天勤生物技术有限公司（生产许可证号：SCXK（湘）2014-0011，使用许可证号：SYXK（湘）2014-0011），按照国际实验动物使用标准，在温度（22.0±0.5）℃、相对湿度（55±5）%，适应性饲养7 d后进行实验。

桑葚干品（批号140504）购自中国贵州省贵阳市同济堂中药饮片有限公司，由贵州省贵州师范大学药物质量控制及评价技术工程实验室陈华国教授鉴定为桑葚成熟果穗，根据前期课题组制备MFP的方法[9]，提取得到MFP（纯度约为92%）。

谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（asparate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活力检测试剂盒 上海古朵生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

XS105DU型十万分之一分析天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司；Max Plus 384光吸收酶标仪 上海美谷分子仪器有限公司；MI-12光学显微镜 广州明美生物有限公司；Animal-6008 GRT型血液分析仪 济南格利特科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及给药处理

急性肝损伤模型（1～7 d）：将小鼠适应性喂养7 d后，随机分成空白组、模型组、阳性组、MFP组，每组10 只，除空白组腹腔注射等体积的生理盐水外，其余3 组小鼠腹腔注射0.1 mL/（10 gmb·d）CdCl2溶液（CdCl2剂量为2 mg/（kgmb·d）），2 h后，均采用灌胃的方式进行干预，空白组与模型组给予等体积的生理盐水，阳性组给予0.1 mL/（10 gmb·d）联苯双酯溶液（剂量为220 mg/（kgmb·d）），MFP组给予0.1 mL/（10 gmb·d）MFP溶液（剂量为50 mg/（kgmb·d）），连续给药7 d后，禁食不禁水，12 h后，摘眼球取血，脱臼处死小鼠，迅速取小鼠肝脏并称量质量。将肝脏分为两部分，一部分浸泡于10%中性甲醛溶液中，低温固定，用于肝脏病理切片观察，另一部分放置于-80 ℃冰箱中，用于肝匀浆生化指标检测[12-15]。

慢性肝损伤模型（1～28 d）：除造模给药时间为28 d外，其余处理均与急性肝损伤模型相同。

1.3.2 动物行为及体征变化

每天观察小鼠的活动、精神状态、进食量、毛发及死亡量等情况，称量并记录小鼠体质量。

1.3.3 肝脏指数测定

将小鼠处死后，取完整的肝脏，称质量，按下式计算肝脏指数[16]。

式中：mA为小鼠肝脏质量/g；mB为小鼠体质量/g。

1.3.4 血常规检测

小鼠眼球取血，将约1 mL全血放置于2 mL乙二胺四乙酸抗凝管中，轻轻摇晃，混匀，静置2 min，使用GRT型血液分析仪，测定血小板（platelet，PLT）、血小板压积（plateletocrit，PCT）、平均血小板体积（mean platelet volume，MPV）、红细胞（red blood cell，RBC）、红细胞压积（hematocrit，HCT）、平均红细胞体积（mean corpusular volume，MCV）、血红蛋白（hemoglobin，HGB）、红细胞平均血红蛋白（mean corpusular hemoglobin，MCH）、红细胞平均血红蛋白质量浓度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）、白细胞（white blood cell，WBC）、淋巴细胞（lymphocyte，LYM）、单核细胞（monocyte，MON）水平。

1.3.5 肝匀浆生化指标检测

取部分肝脏，按照1∶9（m/V）加入质量分数0.9%的生理盐水，配成肝匀浆组织液[17]，匀浆后4 ℃下离心（3 000 r/min、10 min），取上清液，分别参考相应试剂盒说明书测定小鼠肝匀浆上清液中AST、ALT、ALP活力。

1.3.6 肝脏组织病理学观察

参考文献[18-19]进行肝脏组织病理学观察。采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，封片，在光学显微镜下观察肝脏病理学形态变化。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 26.0软件进行分析，实验数据以平均值±标准差表示，以单因素方差分析进行多组间差异比较，采用最小显著差异（least significant difference，LSD）t检验，P＜0.05表示组间差异显著；P＜0.01表示组间差异极显著。

2 结果与分析

2.1 桑葚多糖对镉致肝损伤小鼠行为活动及体征变化的影响

在适应性喂养期间，小鼠精神状态好、行动自如、进食量正常、毛发有光泽、无死亡现象，腹腔注射CdCl2溶液后，在小鼠急性肝损伤模型中（1～7 d），模型组小鼠出现精神不佳、进食量减少等不良现象，阳性组与MFP组小鼠症状有明显改善，小鼠体质量变化如图1所示，空白组小鼠体质量整体呈上升趋势，其余3 组小鼠的体质量总体呈下降趋势，且与模型组相比，MFP组小鼠体质量下降的情况有所改善。在小鼠慢性肝损伤模型中（1～28 d），模型组小鼠出现精神萎靡不振、毛发粗糙、进食量减少、体质量下降、小鼠死亡等不良现象，阳性组和MFP组小鼠症状有明显改善，小鼠体质量变化如图2所示，空白组小鼠的体质量逐渐增加，其余3 组小鼠的体质量增加较缓慢且趋势较为一致。

图1 MFP对镉致急性肝损伤小鼠体质量的影响Fig.1 Effect of MFP on body mass in mice with acute liver injury induced by cadmium

图2 MFP对镉致慢性肝损伤小鼠体质量的影响Fig.2 Effect of MFP on body mass in mice with chronic liver injury caused by cadmium

2.2 桑葚多糖对镉致肝损伤小鼠肝脏指数的影响

如图3所示，在小鼠急性肝损伤模型中（1～7 d），与空白组相比，其余3 组小鼠的肝脏指数都不同程度的增加，其中MFP组小鼠肝脏指数趋近于空白组，各组之间没有显著性差异。如图4所示，在小鼠慢性肝损伤模型中（1～28 d），与空白组比较，模型组小鼠的肝脏指数明显增大了78.64%，具有极显著性差异（P＜0.01），观察到腹腔注射CdCl2溶液后，小鼠肝脏组织存在肿胀、硬化等现象，表明造模成功；同时，与模型组相比，MFP组的肝脏指数极显著降低了21.20%（P＜0.01），表明MFP可减轻肝硬化等症状，对镉源性肝损伤具有治疗作用。

图3 MFP对镉致急性肝损伤小鼠肝脏指数的影响Fig.3 Effect of MFP on liver index of mice with acute liver injury induced by cadmium

图4 MFP对镉致慢性肝损伤小鼠肝脏指数的影响Fig.4 Effect of MFP on liver index of mice with chronic liver injury induced by cadmium

2.3 桑葚多糖对镉致慢性肝损伤小鼠血常规的影响

2.3.1 血红蛋白

如图5所示，与空白组相比，模型组小鼠的HGB水平为（133.93±6.76）g/L，显著降低了9.93%（P＜0.05），MCH为（14.78±0.48）pg/个，极显著降低了12.28%（P＜0.01），MCHC为（329.67±10.60）g/L，降低了2.51%，说明小鼠腹腔注射CdCl2溶液后，小鼠体内存在贫血现象。其中，与模型组相比，MFP组MCHC为（345.17±11.87）g/L，显著升高了4.7%（P＜0.05），说明MFP对镉源性肝损伤造成的贫血，具有一定的治疗作用。

图5 MFP对镉致慢性肝损伤小鼠HGB（A）、MCH（B）、MCHC（C）水平的影响Fig.5 Effect of MFP on hemoglobin (A), mean corpusular hemoglobin(B) and mean corpusular hemoglobin concentration (C) levels of mice with chronic liver injury induced by cadmium

2.3.2 红细胞

如图6所示，与空白组相比，其他组小鼠的RBC没有显著变化，模型组小鼠的HCT为（40.35±3.40）%，显著降低了8.09%（P＜0.05），MCV为（45.00±0.90）fL，极显著降低了9.78%（P＜0.01），说明小鼠腹腔注射CdCl2溶液后，造血功能异常，出现贫血现象。

图6 MFP对镉致慢性肝损伤小鼠RBC（A）、HCT（B）、MCV（C）水平的影响Fig.6 Effect of MFP on red blood cell (A), hematocrit (B) and mean corpusular volume (C) levels of mice with chronic liver injury induced by cadmium

2.3.3 血小板

如图7所示，与空白组相比，其他组小鼠的PLT没有显著变化，模型组小鼠的MPV为（15.58±3.45）fL，极显著升高了55.8%（P＜0.01），PCT为（0.90±0.26）%，极显著升高了83.67%（P＜0.01），说明小鼠腹腔注射CdCl2溶液后，凝血功能出现异常。

图7 MFP对镉致慢性肝损伤小鼠PLT（A）、MPV（B）、PCT（C）水平的影响Fig.7 Effect of MFP on platelet (A), mean platelet volume (B) and plateletocrit (C) levels of mice with chronic liver injury induced by cadmium

2.3.4 白细胞

如图8所示，与空白组相比，其他组小鼠的LYM没有显著变化，模型组小鼠WBC为（6.88±2.08）×109个/L，极显著升高了152.94%（P＜0.01），MON为（1.59±0.77）×109个/L，极显著升高了169.49%（P＜0.01），提示小鼠腹腔注射CdCl2溶液后，体内存在一定的炎症反应。

图8 MFP对镉致慢性肝损伤小鼠WBC（A）、LYM（B）、MON（C）水平的影响Fig.8 Effect of MFP on white blood cell (A), lymphocyte (B) and monocyte (C) levels of mice with chronic liver injury induced by cadmium

2.4 桑葚多糖对镉致肝损伤小鼠肝匀浆生化指标的影响

如图9所示，在小鼠急性肝损伤模型中（1～7 d），与空白组相比，模型组小鼠肝脏中AST、ALT、ALP活力均显著升高（P＜0.05，P＜0.01），提示造模成功。与模型组小鼠AST活力（（25.90±7.66）U/L）比较，MFP组AST活力极显著下降了33.32%（P＜0.01）；与模型组小鼠ALT活力（（35.95±2.30）U/L）比较，MFP组ALT活力极显著下降了33.38%（P＜0.01）；与模型组小鼠ALP活力（（5.16±1.16）IU/L）比较，MFP组ALP活力极显著下降了34.11%（P＜0.01），说明MFP可用于治疗急性镉源性肝损伤。如图10所示，在小鼠慢性肝损伤模型中（1～28 d），与空白组相比，模型组小鼠肝脏中AST、ALT、ALP活力均极显著升高（P＜0.01），提示造模成功。与模型组小鼠AST活力（（50.39±5.05）U/L）比较，MFP组AST活力极显著下降了27.01%（P＜0.01）；与模型组小鼠ALT活力（（66.04±9.70）U/L）比较，MFP组ALT活力极显著下降了33.46%（P＜0.01）；与模型组小鼠ALP活力（（5.76±0.49）IU/L）比较，MFP组ALP活力（（4.05±0.52））IU/L极显著下降了29.69%（P＜0.01），说明MFP可用于治疗镉源性肝损伤。

图9 MFP对镉致急性肝损伤小鼠肝组织中AST（A）、ALT（B）、ALP（C）活力的影响Fig.9 Effect of MFP on activities of AST (A), ALT (B) and ALP (C) in liver tissue of mice with acute liver injury induced by cadmium

图10 MFP对镉致慢性肝损伤小鼠肝组织中AST（A）、ALT（B）、ALP（C）活力的影响Fig.10 Effect of MFP on activities of AST (A), ALT (B) and ALP (C)in liver tissue of mice with chronic liver injury induced by cadmium

2.5 桑葚多糖对镉致肝损伤小鼠肝组织病理学形态的影响

如图11所示，在小鼠急性肝损伤模型中（1～7 d），空白组小鼠肝细胞结构完整，排列整齐，细胞核大小正常、清晰可见；模型组小鼠肝细胞破裂、排列紊乱，细胞核有空泡现象；与模型组相比，阳性组和MFP组小鼠肝细胞损伤程度明显减弱，肝细胞无明显的破裂、肿胀现象。如图12所示，在小鼠慢性肝损伤模型中（1～28 d），空白组小鼠肝细胞结构完整，细胞质无组织学异常，排列整齐；模型组小鼠肝细胞排列紊乱，有大量的炎性细胞浸润，细胞核空泡现象严重，有出血现象，肝细胞损伤现象明显；阳性组与MFP组小鼠肝细胞坏死、炎性细胞浸润现象明显减弱，说明MFP对于镉源性肝损伤具有治疗作用。

图11 MFP对镉致急性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响（×400）Fig.11 Effect of MFP on pathological changes of liver tissue in mice with acute liver injury induced by cadmium (× 400)

图12 MFP对镉致慢性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响（×400）Fig.12 Effect of MFP on pathological changes of liver tissue in mice with chronic liver injury induced by cadmium (× 400)

3 讨 论

镉是人体非必需元素，可在生物体内富集，通过食物链进入人体引起急、慢性中毒，导致肝、肾等器官损伤。AST、ALT、ALP是动物体内重要的转氨酶，当肝脏发生损伤时，肝细胞结构受到一定破坏，AST、ALT、ALP活力升高，是诊断肝细胞受损的重要指标[20]，对于肝损伤的早期确诊、预防、治疗具有重要意义[21]。舒广文等[22]研究发现，MFP可通过降低肝组织中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6含量，减弱核因子-κB p65蛋白的表达，从而抑制肝脏炎症反应的发生，对急性肝损伤起到保护作用。Zhou Xin等[23]研究发现MFP可通过激活乙醇脱氢酶、清除自由基和抑制脂质过氧化等途径发挥保肝作用。本实验通过建立镉源性肝损伤模型，探究MFP对镉源性肝损伤的保护作用，研究结果表明，模型组小鼠的AST、ALT、ALP活力显著升高，表明镉对肝脏造成了一定程度的损伤，相比模型组，MFP组的这些指标均显著性降低，表明MFP可以有效减轻镉造成的肝损伤。

此外，从肝脏的组织病理学来看，与空白组相比，模型组小鼠的肝脏均出现肝细胞排列松散、胞浆内充满小空泡、炎性细胞浸润及肝细胞出血等现象，而MFP组的肝细胞病理现象得到明显改善，再次表明MFP对于镉源性肝损伤具有一定的治疗作用。

血液循环系统是重金属最为敏感的靶系统之一，重金属可显著抑制人类与动物的初次与二次免疫，是造成多种病变发生的原因之一[24-25]。血液系统中最能体现功能性的细胞是红细胞、白细胞等。已有研究表明，随着铅、镉等重金属在机体内的蓄积，白细胞、血红蛋白等细胞含量发生异常，最终导致机体能量代谢、物质合成等生理活动被抑制[26]。杨大千[27]的研究表明，氯化汞溶液可导致小鼠产生再生障碍性贫血。本实验研究了MFP对镉源性肝损伤小鼠血常规的影响，结果表明，与空白组相比，镉显著降低了模型组小鼠的HGB水平，造成机体贫血，采用传统MCV、MCH、MCHC 3 项分类法，结合临床表现，对小鼠贫血类型进行鉴别，判断镉源性肝损伤小鼠可能为单纯小细胞性贫血[28]。相比模型组，MFP组的MCH、MCHC、HGB水平升高，可有效缓解并减轻贫血现象，其次，与空白组相比，模型组小鼠MPV、WBC水平极显著增加，表明机体存在凝血功能异常、病毒感染等病理现象，而MFP组中这些指标逐渐下降。由此可见，MFP对进入血液中的镉具有拮抗作用，在一定程度上可以缓解镉对血液循环系统的损坏。结合前期的研究结果，推测MFP改善血液循环系统的机制是：1）MFP为生物抗氧化剂，可清除氧自由基，发挥抗氧化作用[23]；2）MFP可增强机体的免疫功能，明显缓解镉引起的代偿性反应，使白细胞数量逐渐降低[29-31]；3）MFP可有效螯合镉等重金属，形成稳定的络合物，促进镉的排泄，使血液MCHC、PLT等逐渐恢复正常水平[32]。

综上，重金属镉对肝脏具有强毒性，可以造成机体肝损伤及血液系统紊乱，MFP可以减少镉在肝脏中的蓄积量及损害程度，对小鼠肝脏具有保护作用。