挤压和酶解挤压对豌豆粉淀粉体外消化率、蛋白质结构和流变特性的影响

戚明明，彭慧慧，宋佳琳，张 静，王思花，马成业,2,*

（1.山东理工大学农业工程与食品科学学院，山东 淄博 255000；2.山东省高校农产品功能化技术重点实验室，山东 淄博 255000）

豌豆是世界上第四大豆类作物，种植范围广，约含有53%的淀粉、24%的蛋白质和20%的膳食纤维；在北美和欧洲，豌豆常被粉碎并与其他谷物混合制成复合饲料；在亚洲和南美，豌豆的最大用途是供人类食用[1-2]。豌豆淀粉、豌豆蛋白和豌豆纤维常被分别提取出来，在食品工业中起不同的作用；豌豆淀粉由于其热黏度、凝胶透明度和强度高等特点，一般作为粉丝和凉皮的加工原料[3]；豌豆蛋白含有丰富的必需氨基酸，如赖氨酸相对含量为7.2%，是必需氨基酸的良好来源，可作为氨基酸增强剂应用于食品行业中[4-5]。豌豆种皮的主要成分为纤维素、半纤维素、木质素等，可被磨成纤维粉，制作高纤维面包，促进肠胃蠕动[1,5]；但是在国内，整粒豌豆的食用方式较为单一，常作为蔬菜、零食等被人们所食用。因此，对豌豆进行挤压和酶解挤压改性处理，能进一步扩展豌豆的应用范围。

挤压是一种常见的物理改性食品的方法，具有连续、高效、能耗低、污染小等优点，已广泛应用于谷物、豆类的生产加工中[6]。淀粉分为快消化淀粉（rapidly digestible starch，RDS）、慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS）和抗性淀粉（resistant starch，RS），其中SDS具有特殊的生理功能，它具有能被人体缓慢吸收、持续释放能量、维持餐后血糖稳定、提供长时间的饱腹感等特点[7-8]。淀粉在挤压过程中受到高温、高压、高剪切力等作用，部分支链淀粉降解为直链淀粉，所以总的直链淀粉含量升高，支链淀粉含量降低；短的直链淀粉重新排列，可显著提高SDS含量[9-10]。

酶解法是一种提高SDS含量的高效环保方法。普鲁兰酶能专一性作用于淀粉的α-1,6-糖苷键，淀粉分子经过脱支处理后，产生更多的短链淀粉；在适当条件下回生一段时间，这些短链淀粉相互聚集，重新排列，形成一定量的SDS[11-12]。但是由于淀粉颗粒是致密的半结晶材料，对酶的渗透和水解具有很强的抵抗力，因此，对淀粉进行挤压处理后，淀粉颗粒破裂，结晶结构被破坏，脱支酶更易进入淀粉内部，改变淀粉的性质[13]。

近年来，随着人们生活水平提高，糖尿病、肥胖等慢性疾病的发生率在不断的升高，SDS因其独特的生理功能被越来越多的学者所关注，在食品和饮料中添加适当的SDS可以提升食品品质。本实验通过挤压和酶解挤压改性豌豆粉，以期提高豌豆粉中SDS的含量，并研究挤压和酶解挤压对豌豆粉中蛋白质二级结构和豌豆粉的糊化特性、流变特性等影响；本实验旨在为豌豆在食品行业中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豌豆（淀粉质量分数（52.00±3.16）%、蛋白质量分数（19.11±0.01）%、灰分质量分数（2.40±0.03）%、脂肪质量分数（1.77±0.09）%、水分质量分数（11.32±0.02）%）由山东健源生物工程股份有限公司提供。

普鲁兰酶（EC 3.2.1.41，1 500 U/mL） 江苏锐阳生物科技有限公司；猪胰α-淀粉酶（A3176，19.6 USP/mg） 美国Sigma-Aldrich有限公司；淀粉葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.3，100 000 Units/mL） 上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HT-25粉碎机 山东天华机械农业有限公司；UVTE36-24双螺杆挤压机 长沙创享生物科技有限公司；Quanta200F扫描电子显微镜 德国FEI公司；D8 ADVANCE X射线衍射仪 德国Bruker AXS有限公司；Nicolet 5700傅里叶变换红外光谱 美国热电有限公司；RVA 4500快速黏度分析仪（rapid viscosity analyzer，RVA） 瑞典Perten仪器公司；Kinexus Lab+旋转流变仪 英国Marlvern仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 制备挤压豌豆粉

先用粉碎机将豌豆粉碎，得到原豌豆粉；用双螺杆挤压机将原豌豆粉进行挤压处理，设置挤压条件：喂料速率为15 kg/h；水分质量分数为45%；螺杆转速为160 r/min；温度设置为喂料区60 ℃、混合区90 ℃、剪切区60 ℃、输送区50 ℃、出料区50 ℃。挤出物在室温下干燥并粉碎过100 目筛，于密封袋中室温保存。

1.3.2 制备酶解挤压豌豆粉

称取挤压豌豆粉165 g（干基）加入1 000 mL 0.1 mol/L pH 5.2的乙酸-乙酸钠缓冲液，搅拌均匀后沸水浴糊化；将该淀粉糊冷却至55 ℃，加入普鲁兰酶（每克豌豆粉添加120 U），水浴振荡10 h后，再沸水浴灭酶，将酶解后的豌豆粉用蒸馏水洗涤3 次并以3 000 r/min离心10 min；收集沉淀放入4 ℃冰箱冷藏24 h，再在40 ℃烘箱中干燥24 h，之后粉碎过100 目筛，于密封袋室温保存备用。

1.3.3 扫描电子显微镜观察

将原豌豆粉、挤压豌豆粉和酶解挤压豌豆粉冷冻干燥后粘附在导电胶上，喷金处理，电压10 kV，放大倍数2 000 倍。

1.3.4 X射线衍射分析

取适量样品于检测片上，设置测试条件为Cu-Kα放射检测器，扫描范围2θ为3°～40°，扫描步长为0.02°，扫描时间0.1 s，电压40 kV，电流40 mA。用Jade 6软件计算相对结晶度。

1.3.5 傅里叶变换红外光谱分析

样品和干燥的KBr以质量比1∶30充分混合研磨，压制成片。扫描范围为4 000～400 cm-1，扫描次数32 次，分辨率4 cm-1。蛋白质二级结构（酰胺I带，1 700～1 600 cm-1）用Peakfit 4.2软件进行分峰，并计算α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲的相对含量。

1.3.6 糊化特性测定

用RVA自带软件进行水分校正，配制水分质量分数10%的样品。样品先在50 ℃加热1 min，然后以6 ℃/min的速率升温至95 ℃，再在95 ℃下持续2 min，之后以6 ℃/min的速率冷却至50 ℃并保温2 min。获得主要参数包括峰值黏度、谷值黏度、终值黏度、崩解值和回生值。

1.3.7 淀粉体外消化特性测定

采用Englyst等[7]的方法测定样品的淀粉体外消化率。总淀粉（total starch，TS）、RDS、SDS和RS含量分别按公式（1）～（4）计算。

式中：CTG表示样品中总葡萄糖含量/（g/100 g）；CFG表示样品中自由葡萄糖的含量/（g/100 g）；CG20表示样品在20 min时释放的葡萄糖含量/（g/100 g）；CG120表示样品在120 min时释放葡萄糖的含量/（g/100 g）。

1.3.8 流变特性测定

1.3.8.1 频率扫描

设置频率扫描范围为0.01～10 Hz，温度25 ℃，应变1%。记录储能模量（G’）和损耗模量（G”）的变化。线性黏弹区的确定参数为：温度25 ℃、频率1 Hz、应变范围0.1%～100%。

1.3.8.2 温度扫描

设置温度范围为25～95 ℃，升温速率5 ℃/min，频率1 Hz，剪切应力1 Pa，记录温度变化下G′和G″的变化。

1.4 数据统计与分析

所有实验重复3 次，结果以平均值±标准偏差的形式表示，用Origin 9软件作图，用SPSS 25.0软件进行显著性分析（Duncan多重比较，P＜0.05表示差异显著）。

2 结果与分析

2.1 挤压和酶解挤压对豌豆粉微观形貌的影响

由图1可知，原豌豆粉、挤压豌豆粉和酶解挤压豌豆粉的微观形态显著不同。豌豆主要由淀粉、蛋白质和纤维素组成；原豌豆淀粉主要呈椭圆形、卵形，还有些不规则形状，很多蛋白质颗粒和纤维素附着在上面；淀粉颗粒的表面大多较为光滑，但有一些表面具有裂痕和沟槽（图1A），这是豌豆淀粉的主要特征。挤压后淀粉的形状改变，呈不规则形状，颗粒大小不均，蛋白质更加散乱地分散在淀粉周围，淀粉表面呈现一些裂纹，淀粉的完整结构被破坏（图1B）；酶解挤压后，淀粉的粒状结构消失，形成了表面具有更多凹坑和裂缝但内部结构较为紧密的不规则形态（图1C），这是普鲁兰脱支酶水解了淀粉的α-1,6-糖苷键，直链淀粉在冷藏过程中回生聚集导致的[14]。

图1 原豌豆粉（A）、挤压豌豆粉（B）和酶解挤压豌豆粉（C）的扫描电子显微镜图Fig.1 SEM images of native (A), extruded (B) and hydrolyzed extruded (C) pea flour

2.2 挤压和酶解挤压对豌豆粉结晶结构的影响

X射线衍射图谱中，衍射峰表征结晶结构，非结晶峰对应无定形区，通过研究X射线衍射图谱中尖峰衍射特征和弥散衍射特征可以确定淀粉颗粒的结晶结构。由图2可知，原豌豆粉在15.4°、17.2°和22.6°处有较强的衍射峰，说明豌豆淀粉是典型的A型和B型混合晶型，即为C型[15]，相对结晶度为32.69%。挤压处理后，豌豆粉的峰强度减弱，相对结晶度显著降低至20.34%，挤压导致分子内和分子间的氢键断裂，双螺旋结构解体，进一步破坏了淀粉的结晶结构，结晶区被转变为无定形区；普鲁兰酶水解挤压豌豆粉并冷藏回生24 h后，豌豆粉在16.9°和21.8°处有衍射峰，峰强相比挤压豌豆粉有所增强，但与原豌豆粉相比有所减弱，相对结晶度为25.55%，相对结晶度比挤压后增大，一方面可能是由于普鲁兰酶水解发生在淀粉的无定形区，使得结晶区在淀粉颗粒中所占比例增大；另一方面，酶解挤压豌豆粉后，低温冷藏回生使直链淀粉重新聚集形成晶体结构[16-17]。

图2 原豌豆粉、挤压豌豆粉和酶解挤压豌豆粉的X射线衍射图谱Fig.2 XRD images of native, extruded and hydrolyzed extruded pea flour

2.3 挤压和酶解挤压对豌豆粉短程有序结构和蛋白质二级结构的影响

图3A为原豌豆粉、挤压豌豆粉和酶解挤压豌豆粉的傅里叶变换红外光谱图。3 700～3 000 cm-1之间的吸收峰与O—H的伸缩振动有关，与原豌豆粉相比，挤压豌豆粉和酶解挤压豌豆粉的吸收峰向高波数方向移动，说明挤压和酶解挤压导致分子间发生氢键相互作用[18]；2 900 cm-1处的吸收峰是由样品中脂肪烃中—CH2—振动引起的，1 743 cm-1处的吸收峰是由豌豆粉中脂肪和支链淀粉之间的络合物引起的[19]。酰胺I带（1 700～1 600 cm-1）和酰胺II带（1 600～1 500 cm-1）的峰值分别在1 651 cm-1和1 643 cm-1处；1 651 cm-1处吸收峰可能由酰胺基的N—H弯曲振动以及C＝O、C＝C或C＝N拉伸振动引起；1 535 cm-1处的谱带是由C＝C拉伸振动引起的；1 400～650 cm-1范围内包含大量的吸收峰，由C—O、C—C和C—N等单键的振动引起，以及C—O—C、C—O的糖苷键的拉伸振动；996～992 cm-1处的谱带与羟基的氢键有关，该羟基对水分子敏感[19-20]。

1 045 cm-1和1 022 cm-1处吸收峰分别对淀粉的有序结构和无定形区变化敏感，因此，的比值用来表征淀粉中短程有序结构的数量，该比值越大，短程有序结构越多。原豌豆粉的为1.03，挤压和挤压酶解后分别为0.97和1.01；说明由普鲁兰酶断裂的α-1,6-糖苷键产生的直链淀粉冷却回生后重新聚集形成短程有序结构。

用Peakfit软件对酰胺I带（1 600～1 700 cm-1）进行分峰处理，以分析蛋白质的二级结构。1 650～1 660 cm-1范围的谱带归属为α-螺旋，1 600～1 640 cm-1和1 670～1 690 cm-1范围的谱带归属为β-折叠，1 660～1 670 cm-1和1 690～1 700 cm-1范围的谱带归属为β-转角，1 640～1 650 cm-1范围的谱带为无规卷曲[21]。从图3B～D可以看出，原豌豆粉中蛋白质的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲相对含量分别为16.49%、55.66%、12.07%和15.78%；挤压后α-螺旋和β-折叠相对含量分别降低为16.36%和44.85%，β-转角和无规卷曲相对含量分别增加至21.96%和16.83%；与挤压豌豆粉相比，酶解挤压后α-螺旋结构消失，β-折叠相对含量升高至51.75%，β-转角相对含量降低至21.78%，无规卷曲相对含量增加至26.47%。α-螺旋代表蛋白质的有序结构，在加热条件下，蛋白质变性，α-螺旋结构解开而呈现相对含量减少的趋势[22]；在挤压过程中，豌豆粉受到高温、高压和高剪切力的作用，蛋白质发生部分变性，α-螺旋相对含量减少，无规卷曲相对含量增加；酶解处理使得蛋白质完全变性，因此酶解后的豌豆粉中未检测到α-螺旋结构。β-折叠相对含量与豆类蛋白质的消化率呈负相关[23]，挤压后β-折叠相对含量减少，说明挤压提高了豌豆蛋白的消化率，这对挤压在豆类中的应用具有重要意义。Day等[24]的研究表明大豆、小麦等原料受挤压后其中的蛋白质形成了更多的未折叠结构（无规卷曲）。β-折叠是蛋白质聚集是形成良好凝胶的基础结构[25]，酶解挤压后豌豆粉的β-折叠相对含量较挤压后增加，表明酶解后蛋白质间的聚集程度增加。

图3 原豌豆粉、挤压豌豆粉和酶解挤压豌豆粉的傅里叶变换红外光谱图和酰胺I带峰拟合图Fig.3 FTIR images of native, extruded and hydrolyzed extruded pea flour and peak fitting of amide I bands

2.4 挤压和酶解挤压对豌豆粉糊化特性的影响

原豌豆粉、挤压豌豆粉和酶解挤压豌豆粉的糊化特性如图4所示。原豌豆粉呈现出典型的RVA曲线，挤压处理后样品黏度显著降低，酶解挤压后，样品黏度降低至10 mPa·s左右。峰值黏度、谷值黏度、终值黏度、崩解值和回生值见表1。

图4 原豌豆粉、挤压豌豆粉和酶解挤压豌豆粉的糊化特性曲线Fig.4 RVA curves of native, extruded and hydrolyzed extruded pea flour

表1 原豌豆粉、挤压豌豆粉和酶解挤压豌豆粉的糊化特性Table 1 Pasting properties of native, extruded and hydrolyzed extruded pea flour

峰值黏度是淀粉颗粒膨胀和破裂平衡时的黏度，峰值黏度很大程度上取决于受损淀粉的量，受损淀粉含量越高，峰值黏度越低[26]。挤压破坏了淀粉颗粒，淀粉颗粒的溶胀度和持水能力降低，颗粒易破裂，导致峰值黏度降低；酶解处理后，淀粉分子被完全破坏，峰值黏度进一步降低。崩解值表示淀粉的热稳定性和抗剪切能力，崩解值越小，热稳定性和抗剪切能力越好；回生值表示淀粉在短时间内回生的趋势，回生值越大，越容易回生[26]。原豌豆粉、挤压豌豆粉和酶解挤压豌豆粉的崩解值依次显著降低，分别为13.67、3.00 mPa·s和1.50 mPa·s，回生值分别为181.00、35.50 mPa·s和9.50 mPa·s。挤压和酶解处理显著提高了豌豆粉的热稳定性和抗剪切能力，降低了回生趋势。可能原因是普鲁兰酶脱支后，短的直链淀粉分子间相互作用减弱，从而产生较低的糊化黏度和回生能力[27]。

2.5 挤压和酶解挤压对豌豆粉消化特性的影响

豌豆粉的主要成分为淀粉，淀粉是为人体提供能量的主要物质，RDS、SDS和RS这3 种淀粉对人体都有重要意义：RDS在小肠内被快速消化（0～20 min），释放出葡萄糖，为人体快速升高血糖；SDS在小肠内消化缓慢但被完全消化（20～120 min），缓慢释放葡萄糖，缓慢升高血糖，为人体持续提供能量和饱腹感；RS是在小肠中不被消化的部分（＞120 min），是一种膳食纤维，能够为人体提供饱腹感，并维持肠道稳态[7-8]。

从表2可以看出，与原豌豆粉相比，挤压处理后RDS含量增加，可能是由于挤压破坏淀粉的结晶结构，水解酶更容易进入淀粉颗粒的内部；酶解处理后RDS含量比原豌豆粉稍有下降，但SDS含量升高，表明普鲁兰酶改变了挤压豌豆粉的结构，稳定的直链淀粉凝胶网络的形成使其缓慢消化能力增加[28]，但RS含量降低，可能原因是普鲁兰酶过量导致淀粉的酶解程度过大，形成大量的短链分子，不利于形成抗酶解的RS[29]。

表2 豌豆粉、挤压豌豆粉和酶解挤压豌豆粉的淀粉体外消化率Table 2 In vitro starch digestibility of native, extruded and hydrolyzed extruded pea flour

2.6 挤压和酶解挤压对豌豆粉流变特性的影响

2.6.1 频率扫描

G’和G”分别是表示样品弹性和黏性的量度。从图5可以看出，G’大于G”，且G’和G”都随着频率的增加而增大，说明G’和G”具有频率依赖性，且样品的弹性大于黏性。G’与凝胶网络中交联密度直接相关[30]，挤压和酶解挤压处理后，G’和G”均增大，说明凝胶的刚度、强度和黏弹性都增加。

图5 原豌豆粉、挤压豌豆粉和酶解挤压豌豆粉的频率扫描曲线Fig.5 Frequency sweep curves of native, extruded and hydrolyzed extruded pea flour

淀粉的流变体系由分散相（支链淀粉）、连续相（直链淀粉）和分散相与连续相之间的相互作用来组成[31]。原豌豆粉在频率扫描下，淀粉颗粒吸水膨胀，只有少量直链淀粉渗出，分子间作用较弱，G’和G”的增加幅度为10 Pa左右。挤压后，淀粉颗粒破裂，G’和G”比原豌豆粉高，但是其变化趋势与原豌豆粉一致，挤压对豌豆淀粉有部分破坏作用，直链淀粉更易从淀粉颗粒中渗出并相互作用导致G’和G”升高。与原豌豆粉和挤压豌豆粉相比，酶解挤压豌豆粉的G’和G”明显升高。Aberle等[32]研究发现直链淀粉更易形成不溶性强的凝胶网络。酶解处理后，分子间的相互作用是由直链分子主导，直链分子可以相互渗透，引起分子间前的结缠作用[33]。脱支处理后，直链淀粉具有更好的流动性，更易重新排列、结缠并聚集形成更强的凝胶结构。在豌豆粉的流变体系中，蛋白质也起一定的作用，蛋白质在扫描频率变化下也会发生一定的重排导致网络结构的变化，但豌豆粉中淀粉和蛋白质的相互作用还需进一步研究。

2.6.2 温度扫描

如图6所示，原豌豆粉在达到淀粉的糊化温度之前，G’和G”基本保持不变；在65 ℃左右，G’和G”开始急剧增大，这是因为淀粉颗粒膨胀，直链淀粉渗出，三维凝胶网络开始形成[34]；在70～75 ℃之间达到最大值，之后G’和G”逐渐降低，说明凝胶网络开始崩解，这主要是由于溶胀颗粒中支链淀粉的解结缠以及直链淀粉之间的作用减弱[35]。挤压豌豆粉的变化趋势和原豌豆粉基本一致；在55 ℃之前，G’和G”缓慢增大，是由于部分破裂的淀粉颗粒的膨胀能力减弱，直链淀粉少量渗出相互缠绕；在55～75 ℃之间，G’和G”急剧增大并达到最大值，但其值小于原豌豆粉，说明凝胶硬度降低，颗粒抗破裂能力降低；在75 ℃之后，G’和G”逐渐降低，但比原豌豆粉高，说明高温下挤压豌豆粉的黏弹性优于原豌豆粉。酶解挤压豌豆粉的G’和G”在55 ℃之后仍有一定的增加，但增加幅度远低于原豌豆粉和挤压豌豆粉，这主要是由于脱支酶完全破坏淀粉颗粒，淀粉失去吸水膨胀能力；持续升温，直链分子之间弱的相互缠绕导致G’和G”的轻微升高。在整个升温过程中，酶解挤压豌豆粉表现出的黏弹性都优于挤压豌豆粉和原豌豆粉，说明酶解处理能显著提高豌豆粉对温度的稳定性，这对食品加工与应用具有重要意义。

图6 原豌豆粉、挤压豌豆粉和酶解挤压豌豆粉的温度扫描曲线Fig.6 Temperature sweep curves of native, extruded and hydrolyzed extruded pea flour

3 结 论

本实验研究了挤压和酶解挤压处理对豌豆粉理化性质的影响。结果发现，挤压处理通过高温、高压和高剪切力作用能够改变豌豆淀粉和蛋白质的结构，酶解脱支进一步改变淀粉的理化性质；表现为与原豌豆粉相比，挤压豌豆粉和酶解挤压豌豆粉相对结晶度降低，α-螺旋相对含量降低（挤压处理）甚至消失（酶解处理），β-折叠相对含量降低，β-转角相对含量升高，黏度下降，崩解值和回生值降低，表明挤压和酶解处理后其热稳定性和抗回生性增强。挤压和酶解挤压处理显著提高了SDS含量，降低了RS含量。对3 种样品的流变特性分析发现，酶解可以显著提高豌豆粉的凝胶强度和对温度变化的稳定性。

SDS具有稳定血糖的生理功能，提高豌豆中SDS含量可以使豌豆更广泛地应用于健康食品中；蛋白质是人体的重要组成成分，豌豆蛋白含有较高含量的赖氨酸，可以作为氨基酸增强剂应用于食品行业中，增加对豌豆蛋白的利用率。挤压和酶解挤压后豌豆粉的黏弹性增加，说明挤压和酶解挤压后的豌豆粉被制作成或添加到其他食品时，可以提高产品的黏弹口感；酶解挤压后豌豆粉对温度的稳定性提高，说明其在高温加热过程中性质更稳定。挤压和酶解挤压可以显著改变豌豆粉的理化性质，这对豌豆在生产加工和新产品的研究开发具有重要意义；后续实验中，本课题组将进一步研究用酶解挤压改性后的豌豆粉代替小麦粉制备的豌豆面条的生理功能和理化性质，以扩展豌豆的用途。