交联壳聚糖水凝胶的分子结构差异与其控释性能关系

黄霭珺，项拓，梁刚强，杨婧雯，吴洁仪，叶盛英，司徒文贝

（华南农业大学食品学院，广东广州 510641）

随着社会的发展，人们越来越重视食品的营养健康。功能性食品中具有特殊效应活性物质，与诸多慢性疾病预防密切相关，因而受到广泛关注[1]。但在加工储运及胃肠道运转过程中，活性蛋白类功能因子面临水分、温度、pH值等条件的不利影响[2,3]，为提高此类功能因子的生物利用度，需要运用一定的载体材料对其进行包载[4]，如纤维素、壳聚糖、玉米醇溶蛋白等[5,6]。

在众多的天然材料中，壳聚糖是以β-(1,4)糖苷键连接的带正电荷的多糖，由于其具有良好的生物相容性和降解性，物理、化学性质稳定性，在自组装复合材料、生物聚合物膜和药物递送载体等方面有广泛的应用[7]。目前，壳聚糖及其衍生物可用作生物活性化合物载体，以克服上消化道中不利的生理条件影响（如：低pH值胃酸、各种消化酶），提高药物及活性物质的生物利用率[8]。此外，在低于pH 6.5的酸性水溶液中，CS主链上的氨基质子化[9]，可与三聚磷酸钠、柠檬酸钠等交联剂形成静电连接，生成水凝胶网络[10]。交联网络可包载蛋白质、多肽[11]、小分子药物和DNA片段[12]，以保护活性物质，避免外界环境的侵蚀。有研究表明，交联过程中，离子强度对壳聚糖基水凝胶中的活性物质释放有显著影响[13]。Sang等[14]以三聚磷酸钠（tripolyphosphate，TPP）、植酸和六偏磷酸钠（sodium hexametaphosphate，SHMP）为交联剂，制备了可用于粘膜给药的壳聚糖纳米粒。与TPP相比，植酸或SHMP交联的纳米粒具有更高的包封率和更低的释放率。司徒文贝等[15]以三聚磷酸为交联剂，对壳聚糖进行改性，获得交联壳聚糖水凝胶骨架片，研究表明改性后的交联壳聚糖可有效抵御胃酸腐蚀，能明显降低模型功能因子在胃液中前期的释放率，显示出对活性物质递送的能力。

壳聚糖经交联后，其微观结构会发生变化，从而影响水凝胶的控释性能。前人的研究多从pH、离子强度等对水凝胶的包载性能、控释性能进行探讨，较少对水凝胶制备过程中水凝胶的微观结构、控释性能变化进行探讨。因此，本文选择TPP和SHMP两种常用的离子交联剂，对分子量为150,000 g/mol的壳聚糖进行交联，控制交联剂浓度，获得具有不同微观结构的交联壳聚糖水凝胶，对其链结构、结晶结构、热性能、溶胀性能和释放性能等进行测定，探讨在制备过程中壳聚糖水凝胶微观结构变化与其释放性能之间的相互作用规律，为壳聚糖基载体材料在功能食品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

壳聚糖，上海凯扬生物科技有限公司，分子量150,000 g/mol；牛血清白蛋白（BSA），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；三聚磷酸钠（TPP），广州西龙化工有限公司，分析纯；六偏磷酸钠（SHMP），广州西龙化工有限公司，分析纯。

1.2 仪器与设备

磁力搅拌器，金坛市城东新瑞仪器厂，型号HJ-6；高速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司，型号H/T16MM；EYELA冷冻干燥机，上海爱朗仪器有限公司，型号FDU-1200；FT-IR光谱仪，塞默飞世尔科技有限公司，型号Thermo Nicolet 380；AXS衍射仪，德国布鲁克公司，型号D8；热重分析仪，德国耐驰公司，型号209 F3；电子扫描显微镜，蔡司公司，型号EVO 18。

1.3 实验方法

1.3.1 交联壳聚糖水凝胶制备

称取1.0000 g壳聚糖，溶于100 mL 1%（V/V）冰醋酸中，25 ℃下磁力搅拌1 h，随后按壳聚糖/交联剂质量比（1、1.667和 3.333，m/m），加入相应的交联剂（交联剂浓度1%m/V）进行交联。交联结束后，溶液pH调至pH 4.8～5.0，10000 r/min离心10 min，得到沉淀物，水洗3次，得到不同的交联壳聚糖水凝胶。部分水凝胶经冷冻干燥、研磨和粉碎，用于后续表征实验。

1.3.2 交联壳聚糖水凝胶的表征

利用傅里叶红外光谱仪，采用溴化钾压片法进行制样，以空气为背景，对样品的相关官能团及化学键进行测定，设置分辨率为4 cm-1，利用DTGS检测器先扫去空气的空白，扫描波数在 4000～400 cm-1范围内，扫描64次，取平均值[16]。

利用粉末X射线衍射仪，在Cu-Kα辐射（λ=0.1542 nm）、40 kV、40 mA、范围 5 °～45 °、步长 0.033 °的条件下，对样品粉末的晶体结构进行测定[17]。

采用热重分析仪对样品的热性能进行分析。精确称取4 mg样品粉末置于铝盘中，在氮气氛围下，以10 ℃/min的速度，从30 ℃升温至650 ℃，记录样品的重量变化[18]。

采用液氮对交联壳聚糖水凝胶进行脆断，获得水凝胶断面，通过导电胶将断面粘在样品台上，喷金后，通过电子扫描显微镜，在10.00 kV下进行观察。

另外，参考文献提及方法[19,20]，称取0.5000 g（精确到0.0001 g）样品粉末于离心管中，分别加入20 mL pH 2.2、4.0和7.0的缓冲液，混合后，置于37 ℃水浴100 r/min，2 h后取出，10000 r/min离心20 min，弃去上清液，称溶胀沉淀重量（扣去管重），每个样品平行两次，测定其溶胀率，溶胀率计算公式如下：

式中：

w1——溶胀后沉淀与离心管的总重量，g；

w2——离心管重量，g；

w3——溶胀前称入的粉末重量，g。

1.3.3 体外模拟释放实验

将1.3.1中所述方法，制备壳聚糖-交联剂溶液（pH 4.8），然后将一定量的牛血清白蛋白（BSA）滴入溶液中，搅拌2 h，10000 r/min离心30 min，获得包载有BSA的壳聚糖基水凝胶。并用BCA试剂盒对上清液中的游离BSA进行测定，按照文献中提及的方法对壳聚糖基水凝胶中的BSA包载率进行计算。

另外，参考文献提及方法[21]，将上述包载有BSA的壳聚糖基水凝胶置于200 mL溶出介质中，37 ℃水浴100 r/min。水凝胶在在模拟胃液（pH 1.2）中运转2 h，然后在模拟小肠液（pH 6.8）中运转6 h，最后在模拟结肠液（pH 7.0）中运转38 h。BSA的释放量通过BCA试剂盒测定。

1.4 统计分析

采用SPSS 22.0软件分析实验数据，数据差异性采用单因素方差分析及Duncan检验，显著性水平设为p＜0.05，实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 交联壳聚糖水凝胶的链结构分析

未改性的壳聚糖在 3400 cm-1有羟基和氨基的联合非对称伸缩振动，在1650 cm-1和1560 cm-1的特征峰表征酰胺Ⅰ带的 C=O键的伸缩振动和酰胺Ⅱ带的N-H 键振动峰[22]。壳聚糖上的-NH3+与交联剂中的磷酸基团，通过氢键进行交联，因此，交联后的壳聚糖水凝胶在1650 cm-1附近的峰向1635 cm-1方向发生红移，这与壳聚糖上N-H弯曲振动以及处于缔合态的酰胺Ⅱ带有关。而交联壳聚糖基水凝胶中的磷酸基团在1215～1280 cm-1处有P=O的振动吸收峰，且随着壳聚糖与交联剂质量比的降低，峰强度有所上升，说明更多的磷酸基团参与交联反应[23,24]，这结果与参考文献相近。另外，交联后，由于磷酸基团的反对称伸缩振动，TPP交联壳聚糖基水凝胶在800～900 cm-1有强吸收峰出现，这是P-O-C键的伸缩振动。而SHMP交联壳聚糖基水凝胶则1036 cm-1有吸收峰出现，这是交联剂SHMP中P-OH键的吸收峰[23,25]。

比较两种交联剂，TPP中带有PO3-磷酸基团，而SHMP带有PO43-磷酸基团，在交联反应中，壳聚糖分子链段可相互间形成交联结构，也可以在分子链段内进行交联[11]，而SHMP中可形成更多的作用位点[26]，参与壳聚糖的交联反应[23]，因此，在SHMP交联壳聚糖基水凝胶中，N-H键在1530 cm-1附近的峰强度明显增加[15]，这与交联反应过程中壳聚糖上-NH3+的构象转变以及水凝胶内部交联程度上升形成紧密的网络结构有关。参考文献中曾提及，在SHMP交联壳聚糖水凝胶中有复杂的分子内和分子间交联，使壳聚糖中C2、C3、C5和C6位在13C固体核磁谱图中向低场轻微移动[16]。这与本论文的研究结果一致，交联剂SHMP具有较多的作用位点，通过壳聚糖的分子内和分子间交联，形成复杂的网络结构。

2.2 交联壳聚糖水凝胶的结晶结构分析

未改性的壳聚糖在10.26 °和19.83 °附近出现宽泛的衍射峰，分别代表壳聚糖中结晶区和非晶区[27]，同时结晶区域也与壳聚糖中酰胺键的形成、氨基和羟基之间氢键有关[28]。从图2a看出，交联后，当CS/TPP比值为3.333时，20.06 °附近有一衍射峰，当CS/TPP比值为1.667时，20.06 °附近的衍射峰移至24.43 °，并且峰的强度略有降低。而当CS/SHMP之比为3.333时，CS基凝胶在 20.91 °左右有一峰（图2b）。随着CS/SHMP 比值的降低，峰向 22.73 °～22.83 °方向移动。这说明在交联过程中，分子链重新排列。如前所述，交联后，阴离子交联剂与壳聚糖之间通过氢键而形成网络结构，随着分子链段的重排，水凝胶中的分子内和分子间的作用力增强[18,29]，在不同的壳聚糖/交联剂质量比的影响下，最终生成具有不同结晶结构的交联壳聚糖，水凝胶链结构与结晶结构的改变会影响水凝胶的性能，后续会通过热性能分析及体外控释实验做进一步探讨。

2.3 交联壳聚糖水凝胶的热性能分析

在30～150 ℃范围内出现8.22%的失重，属于未改性壳聚糖天然结构中的水分散失。当CS/TPP的质量比从1增加到3.333时，TPP交联壳聚糖基水凝胶在此温度范围内的失重率分别为 5.82%、6.077%和13.10%（图3a）。当CS/SHMP的质量比从1增加到3.333时，SHMP交联壳聚糖基水凝胶的失重分别为11.76%、11.43%和12.03%（图3b）。在30～150 ℃范围内，壳聚糖基水凝胶的降解与其亲水性有关，由于交联作用，交联剂中的磷酸基团增强了水与壳聚糖分子链的相互结合[30]，所以交联壳聚糖水凝胶在此温度范围内的失重率上升。

从150到600 ℃，由于壳聚糖分子的分解[30]，天然壳聚糖的失重率约为55.15%。当CS/TPP的质量比从1增加到3.333时，TPP交联壳聚糖基水凝胶的失重率分别为 38.87%、38.59%和 41.08%（图 3a）。当CS/SHMP的质量比从1增加到3.333时，SHMP交联壳聚糖基水凝胶的失重率分别为 34.44%、34.99%和37.40%（图 3b）。在 650 ℃下，未改性的壳聚糖有35.10%的重量残留。当 CS/TPP质量比从 1增加到3.333时，TPP交联壳聚糖基水凝胶的物质残留率分别为53.40%、53.45%和43.23%。当CS/SHMP的质量比从1增加到3.333时，SHMP交联壳聚糖基水凝胶的物质残留率分别为50.66%、50.78%和47.94%。

对比两种水凝胶，SHMP交联壳聚糖基水凝胶的失重率要低于TPP交联的，这与壳聚糖基水凝胶分子结构差异有关。与交联剂TPP相比，SHMP交联剂可提供更多的交联作用位点。在FT-IR分析中，由于壳聚糖上-NH3+在交联过程中构象转变以及水凝胶内部交联程度上升而形成紧密的网络结构，SHMP交联的壳聚糖基水凝胶中N-H键在1530 cm-1附近的峰强度明显增加。另外，在交联反应过程中，壳聚糖分子链段重排，破坏其原有的结晶结构，壳聚糖分子通过分子内和分子间的交联，水凝胶内部的作用力逐渐增强，提高了水凝胶的稳定性，所以在热性能分析中，SHMP交联壳聚糖基水凝胶要优于 TPP交联壳聚糖基水凝胶。此处的研究结果与参考文献的相近[18,29]。

2.4 交联壳聚糖水凝胶的形貌分析

图4为交联壳聚糖水凝胶的断面形貌，从断面中可以看出，未改性的壳聚糖原膜的断面均匀，而通过交联剂改性后的水凝胶，其断面结构致密，且随着交联剂用量的提升，断面致密程度增加。对比两种不同的交联剂，采用SHMP交联的壳聚糖水凝胶，其断面的致密程度要比相同条件下TPP交联的壳聚糖水凝胶要大。

在交联后，壳聚糖水凝胶变得致密，这与交联过程形成的网络结构有关。当壳聚糖与交联剂质量比下降，壳聚糖分子链段可形成分子内和分子间的交联，交联程度上升，网络结构越多，水凝胶越致密。这与文献的结果一致，也与前述的XRD分析结果一致，同时，交联过程所形成的网络结构也会进一步改变水凝胶的溶胀性能、控释性能等。

2.5 交联壳聚糖水凝胶的溶胀性能

壳聚糖基水凝胶的溶胀能力与离子交联过程中通过静电作用形成的网络结构密切相关[23]，易受pH的影响，本文通过对壳聚糖基水凝胶在pH 2.2、4.0和7.0条件下的溶胀情况进行测定，结果如表1所示。

当pH为2.2时，随着CS/TPP的质量比从1增加到3.333，TPP交联壳聚糖基水凝胶的溶胀率从13.06%下降到10.83%。当pH为4.0时，TPP交联壳聚糖基水凝胶的溶胀率随CS/TPP质量比的增加，从7.90%下降到6.21%。当pH为7.0时，TPP交联壳聚糖基水凝胶的溶胀率随CS/TPP质量比的增加，从7.84%下降到5.51%。通过对比发现，在相同CS/TPP质量比下，TPP交联壳聚糖基水凝胶的溶胀率随pH的增加而逐渐下降。对于SHMP交联壳聚糖基水凝胶，随着CS/SHMP的质量比从1增加到3.333，SHMP交联壳聚糖基水凝胶的溶胀率从5.40%上升到19.41%。当pH为 4.0时，SHMP交联壳聚糖基水凝胶的溶胀率随CS/SHMP质量比的增加，从4.48%上升到6.73%。当pH为7.0时，SHMP交联壳聚糖基水凝胶的溶胀率随CS/SHMP质量比的增加，从2.97%上升到5.26%。通过对比发现，在相同CS/SHMP质量比下，SHMP交联壳聚糖基水凝胶的溶胀率随pH的增加而逐渐下降，同时，与TPP交联壳聚糖水凝胶相比，SHMP交联壳聚糖基水凝胶的溶胀能力明显减小。

表1 壳聚糖基水凝胶的溶胀能力Table 1 Swelling capacity of CS-based hydrogel.

同一交联壳聚糖基水凝胶在pH 2.2环境下溶胀性能最好，这是由于在酸性环境下溶液中 H+浓度的增加，溶胀的水凝胶与外部溶液之间渗透压增加[22]，使得交联壳聚糖基水凝胶在pH值为2.2时迅速膨胀。随着pH的上升，溶液中的H+数量下降，水凝胶内外的渗透压减小，水分渗透速度减慢，从而降低水凝胶的溶胀率。而在同样的pH条件下，TPP交联壳聚糖基水凝胶随CS/TPP质量比增大，其溶胀率逐渐下降，这是由于CS/TPP质量比增大，TPP可更多地交联壳聚糖分子链段，形成壳聚糖分子内、分子间交联的复杂网络结构。CS/TPP质量比增大，TPP交联壳聚糖基水凝胶的网络结构越紧密，这对水分的向内渗透迁移不利，从而造成水凝胶的溶胀能力下降[18,29]，这也与FT-IR和SEM的分析结果一致。对于SHMP交联壳聚糖基水凝胶，SHMP是一种复杂的磷酸盐混合物，其磷酸盐成分比例随 pH变化，这容易导致壳聚糖与SHMP之间的交联结构解体[14]，从而减少SHMP交联壳聚糖基水凝胶的吸水溶胀能力。这也是SHMP交联壳聚糖基水凝胶的溶胀能力小于TPP交联壳聚糖水凝胶的原因。随CS/SHMP质量比增大，交联剂周围的壳聚糖分子链段增加，致密的水凝胶结构既减缓了水分的渗入，也降低了SHMP交联壳聚糖基水凝胶解体的可能，从而在一定程度上提高水凝胶的溶胀性。

最后，图5展示在不同pH值下交联壳聚糖水凝胶红外光谱。在pH 2.2条件下，周围环境中H+浓度增加，利用水凝胶内外渗透压，水凝胶发生溶胀，在对应的红外图谱中，1750 cm-1附近存在-NH3+基团的振动峰。随着pH的升高，这一峰逐渐减弱并消失，这与该基团转变成N-H带振动（1539 cm-1）有关[23,31]。

2.6 交联壳聚糖水凝胶的体外释放及其变化机理

当CS/TPP比值分别为3.333、1.667和1时，TPP壳聚糖基水凝胶的 BSA的包载率分别为 96.89%、93.43%和10.88%。当CS/TPP的质量比分别为3.333、1.667和1时，在模拟胃液中，TPP壳聚糖基水凝胶中BSA的释放率分别为15.12%、15.82%和15.04%（图6a）。随后，TPP壳聚糖基水凝胶运转到模拟小肠液，在该环境下，BSA逐渐释放。6 h后，TPP壳聚糖基水凝胶转换至模拟结肠液中运转。体外释放实验结束时，牛血清白蛋白的累积释放率分别为 59.90%、70.10%和76.57%。

与此相比，当CS/SHMP的质量比分别为3.333、1.667和 1时，交联壳聚糖水凝胶的包载率分别为99.68%、98.31%和21.70%，在模拟胃液中，BSA释放率分别为14.89%、13.04%和22.41%。当运转至模拟小肠环境，分别有3.164%、19.81%和7.90%的BSA从SHMP交联壳聚糖水凝胶中释放。在整个体外模拟释放过程中，BSA的累积释放率分别为30.47%、47.6%和50.27%。研究报道显示，以TPP交联的壳聚糖水凝胶（质量比4），大约有55%的活性蛋白累积释放率，其中约有45%的活性蛋白释放于模拟上消化道环境，真正释放于结肠部位的活性蛋白较少。而以SHMP交联的壳聚糖水凝胶（质量比4），其活性蛋白的累积释放率则与本研究的相近[10]。

在胃肠道转运过程中，pH值由1.2（模拟胃液）升至6.8（模拟小肠液），再升至7.0（模拟结肠液），水凝胶由酸性介质向中性环境转变。在此过程中，模拟胃液中高浓度的 H+使交联壳聚糖基水凝胶发生溶胀，后续随模拟胃肠道运转，水凝胶逐渐被侵蚀。因此，在上消化道，交联壳聚糖水凝胶中的活性物质是通过载体材料溶胀、水凝胶网络结构的侵蚀以及活性物质分子扩散进行释放的[17]。在模拟结肠液中，交联壳聚糖水凝胶的释放速率下降，这与壳聚糖在中性条件下不溶于水有关，处于水凝胶外围的壳聚糖链段在酸性环境下溶胀后，随胃肠道pH的转变而逐渐不溶于水，从而形成限制内部物质迁移的障碍，因此，BSA在中性的模拟结肠环境中缓慢释放。

而对比两种不同的交联剂，TPP交联壳聚糖基水凝胶在低CS/TPP质量比情况下，在TPP分子周围对壳聚糖分子链段进行分子内和分子间交联，形成复杂致密的水凝胶结构，以保护活性蛋白，减少上消化道环境的侵蚀，增大运送至结肠部位的活性蛋白量。如前所述，SHMP是一种复杂的磷酸盐混合物，其在酸性介质中能被水解成三磷酸钠和正磷酸钠，磷酸基团的改变，会破坏其与壳聚糖-NH3+之间所形成的氢键[14]。在模拟胃酸中，SHMP交联壳聚糖基水凝胶的氢键被破坏，壳聚糖分子链段发生游离，处于水凝胶周围。所以，在模拟胃液运转阶段，BSA从两种水凝胶中的累积释放率相近。

随着模拟小肠液和模拟结肠液的运转，释放介质pH上升，在SHMP交联壳聚糖基水凝胶中，游离的壳聚糖不溶于水，且水解后的磷酸盐可重新与壳聚糖分子链段结合，水凝胶内部发生分子内、分子间的复杂交联。因此，在中性的肠道环境，SHMP交联壳聚糖水凝胶内部仍然致密，而外部有不溶于水的壳聚糖层，共同限制BSA的释放，使得SHMP交联壳聚糖水凝胶在模拟结肠环境的 BSA累积释放率明显低于TPP交联壳聚糖基水凝胶。

3 结论

为提高活性物质的生物利用度，本文通过不同的交联剂，在不同的浓度下对壳聚糖进行离子交联，获得具有不同微观结构的壳聚糖基水凝胶。通过红外光谱和X-射线衍射分析，交联壳聚糖水凝胶通过壳聚糖上的氨基和交联剂中的磷酸基团间形成氢键，使得壳聚糖分子链段间可形成分子内和分子间的相互作用，提升水凝胶空间结构的紧密程度。同时，随着壳聚糖/交联剂质量比的下降，即交联剂用量增加，交联壳聚糖水凝胶紧密性增大。热重分析也表明随着交联程度的提高，壳聚糖基水凝胶的热稳定性上升。由于交联剂分子结构的差异，TPP交联壳聚糖水凝胶在较低pH下具有较好的溶胀性能，所以在模拟胃液环境中，其对BSA的控释能力优于SHMP交联壳聚糖水凝胶。在后续的模拟小肠液和模拟结肠液中，松散的SHMP交联壳聚糖水凝胶由于释放介质pH的提升以及壳聚糖溶解性下降而形成致密结构，减缓BSA在肠道中的快速释放。本文的研究结果可为活性蛋白类功能因子的递送以及功能食品的发展提供一定的参考。